劉豐熙， 牛 凱， 吳志剛， 薛貴平， 楊建明， 張丹參△

(1. 河北北方學(xué)院藥學(xué)系， 張家口 075000； 2. 圣大(張家口)藥業(yè)有限公司， 河北 張家口 075000)

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既濟(jì)湯對(duì)腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響*

劉豐熙1， 牛 凱2， 吳志剛1， 薛貴平1， 楊建明1， 張丹參1△

(1. 河北北方學(xué)院藥學(xué)系， 張家口 075000； 2. 圣大(張家口)藥業(yè)有限公司， 河北 張家口 075000)

目的：本研究旨在探討既濟(jì)湯對(duì)腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的血管性癡呆(VD)小鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響。方法：將32只小鼠隨機(jī)分為4組(n=8):正常組、假手術(shù)組(手術(shù)但不執(zhí)行腦缺血/再灌注)、模型組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型)、既濟(jì)湯治療組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型后既濟(jì)湯治療)。術(shù)后給予既濟(jì)湯20 ml/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d，通過(guò)避暗實(shí)驗(yàn)、探索實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所有小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。最后取腦，檢測(cè)腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，評(píng)價(jià)腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的變化情況。結(jié)果：避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，既濟(jì)湯治療組較模型組動(dòng)物逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著下降(P<0.01)；探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，既濟(jì)湯治療組較模型組顯著縮短小鼠到達(dá)暗室時(shí)間(P<0.05)、到達(dá)高端時(shí)間(P<0.01)、到達(dá)后面明室時(shí)間(P<0.01)，并且顯著增加爬高端的次數(shù)(P<0.01)；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)表明，既濟(jì)湯治療組較模型組能夠顯著延長(zhǎng)小鼠的逃避潛伏期(P<0.01)。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中SOD活性顯著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，既濟(jì)湯治療組小鼠腦組織SOD活性和MDA含量明顯回落(P<0.01，P<0.01)。結(jié)論：既濟(jì)湯可顯著改善VD小鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與其抑制腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。

既濟(jì)湯; 血管性癡呆; 認(rèn)知功能; 氧化應(yīng)激; 小鼠

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是全球范圍內(nèi)僅次于阿爾茨海默病的第二位癡呆性疾病[1]。隨著人口老齡化的來(lái)臨，我國(guó)VD的發(fā)病逐年增加，并有加速的趨勢(shì)[2]。VD不但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且為家庭和社會(huì)增添了沉重經(jīng)濟(jì)和情感負(fù)擔(dān)。目前，雖然已有大量學(xué)者專注于VD的基礎(chǔ)和臨床研究，但臨床上仍沒(méi)有特異性的治療方案，主要從平衡神經(jīng)遞質(zhì)、改善腦循環(huán)以及保護(hù)腦細(xì)胞著手，治療效果不理想。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD屬于中醫(yī)的 “癡呆”、“呆癥”、“健忘”等疾病范疇，病在腦，與心和腎的關(guān)系密切[3]。以往的治療多采用補(bǔ)益心血、補(bǔ)腎益氣、活血化淤、祛痰開(kāi)竅等治療方法，從單一臟腑的角度治療VD。作者立足中醫(yī)的整體觀念，從臟腑間的相互聯(lián)系出發(fā)，認(rèn)為心腎不交可能是VD發(fā)生的重要原因。因此，本文從交通心腎入手，以小鼠為對(duì)象，線栓法建立腦缺血/再灌注損傷VD模型，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察自擬方既濟(jì)湯(在具有鎮(zhèn)靜安神、交通心腎的功效的交泰丸的基礎(chǔ)上加減而成)對(duì)VD的干預(yù)效果，并從氧化應(yīng)激的角度探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

SBA-2程控避暗箱、XTY-2探索運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)儀和STT-2跳臺(tái)儀，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。既濟(jì)湯組方原則是交通心腎、理氣開(kāi)竅。所含中藥：遠(yuǎn)志、黃連、肉桂、益智仁、枸杞子、菟絲子、熟地、石菖蒲、炒棗仁、陳皮、澤瀉、白芍、阿膠和黃芩，均購(gòu)自張家口市華佗藥房，嚴(yán)格按臨床用藥煎煮方法熬制成常規(guī)藥液。1 ml藥液含生藥1克。

1.2 動(dòng)物與分組

健康昆明種雄性小鼠32只，體重(28±2)g，隨機(jī)分為4組(n=8)：分別為正常組、假手術(shù)組(進(jìn)行手術(shù)，但不進(jìn)行腦缺血/再灌注)、模型組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型)、既濟(jì)湯組(復(fù)制腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的VD模型后，既濟(jì)湯治療)。

1.3 模型制備與給藥方法

動(dòng)物麻醉(3.5%水合氯醛10 ml/kg，腹腔注射)后，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，分離后用液體石蠟浸泡過(guò)的黑色手術(shù)線穿過(guò)左右兩側(cè)頸總動(dòng)脈，盡量恢復(fù)兩側(cè)頸總動(dòng)脈到原位，在氣管上方輕輕將黑色手術(shù)線打一松的反手結(jié)，結(jié)的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側(cè)頸總動(dòng)脈上方的黑線上穿過(guò)一條用液體石蠟浸泡過(guò)的白色手術(shù)線，按Himori法埋線后縫合切口[4]。術(shù)后48 h將頸下黑色手術(shù)線拉緊，阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)， 5 min后輕拉兩側(cè)白色手術(shù)線，使頸總動(dòng)脈恢復(fù)血液再灌注。

既濟(jì)湯治療組動(dòng)物每日早7:00灌胃給既濟(jì)湯，20 ml/kg，每天1次，連續(xù)給藥14 d；正常組、假手術(shù)組和模型組動(dòng)物每日早7:00給等量蒸餾水，每天1次，也連續(xù)給14 d。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 避暗實(shí)驗(yàn) 避暗箱有明暗兩間隔室，兩室間有一個(gè)直徑為3 cm圓形通道，兩室底部均為不銹鋼柵欄。明室柵欄始終不通電，暗室柵欄通電(40 V)。小鼠受到電擊后立即逃避到明室，PcLab生物信號(hào)采集系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)收集。第14天給藥后1 h進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和測(cè)試，訓(xùn)練前將小鼠放入避暗箱內(nèi)適應(yīng)3 min，然后將小鼠背向洞口放入明室，由于小鼠具有嗜暗習(xí)性，易進(jìn)入暗室，進(jìn)入暗室后由于受到電擊迅速逃離。在5 min內(nèi)經(jīng)多次電擊，小鼠形成記憶，記錄24 h后3 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))以及首次犯錯(cuò)誤的時(shí)間(逃避潛伏期)。

1.4.2 探索實(shí)驗(yàn) 探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)儀，由一個(gè)暗室和兩個(gè)明室組成，可記錄動(dòng)物的活動(dòng)行為信號(hào)。第14天給藥后1 h進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，首先將小鼠放在前面明室中，同時(shí)打開(kāi)箱門(mén)，當(dāng)小鼠鉆進(jìn)暗室時(shí)，則關(guān)上門(mén)斷其后路。記錄小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間(指后面的明室)和小鼠爬高端的次數(shù)。

1.4.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試儀由5個(gè)隔室構(gòu)成，可同時(shí)測(cè)試5只動(dòng)物，每個(gè)隔室有一橡皮臺(tái)，箱底是可通電的銅柵，訓(xùn)練期，小鼠跳下平臺(tái)在通電后的箱底不斷被電擊，這個(gè)過(guò)程中獲得記憶；24 h后觀察小鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間和3 min內(nèi)跳下平臺(tái)的次數(shù)。第14天給藥后1 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng) 3 min，然后立即通36 V交流電，動(dòng)物受到電擊跳上平臺(tái)，訓(xùn)練 3 min。24 h后，將小鼠輕輕置于平臺(tái)上，記錄從小鼠被放至平臺(tái)到第一次跳下的時(shí)間，即跳臺(tái)潛伏期；同時(shí)記錄 3 min內(nèi)小鼠跳下平臺(tái)的次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5 小鼠腦組織SOD和MDA含量測(cè)定

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，小鼠迅速斷頭處死，冰臺(tái)上取腦，冷生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干表面的水分，稱重，制備10%腦組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。腦組織勻漿用BCA法蛋白定量。SOD活性和MDA含量以腦組織中總蛋白校準(zhǔn)[5]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組和假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)；既濟(jì)湯治療組較模型組動(dòng)物逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著下降(P<0.01)；而且既濟(jì)湯治療組動(dòng)物逃避潛伏期顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01，P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著少于正常組(P<0.05，表1)。探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組動(dòng)物到達(dá)暗室時(shí)間(P<0.05)、到達(dá)高端時(shí)間(P<0.01)和到達(dá)后面明室時(shí)間(P<0.01)都顯著延長(zhǎng)；與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物到達(dá)暗室時(shí)間(P<0.05)和到達(dá)后面明室時(shí)間(P<0.01)顯著延長(zhǎng)；與模型組比較，既濟(jì)湯治療組動(dòng)物到達(dá)暗室時(shí)間(P<0.05)、到達(dá)高端時(shí)間(P<0.01)和到達(dá)后面明室時(shí)間(P<0.01)都顯著縮短，爬高次數(shù)顯著增加(P<0.01)；而且既濟(jì)湯治療組動(dòng)物爬高次數(shù)也顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01，P<0.01)；但既濟(jì)湯治療組動(dòng)物到達(dá)后面明室時(shí)間仍顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05，P<0.05，表2)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：既濟(jì)湯治療組動(dòng)物的逃避潛伏期較模型組、正常組和假手術(shù)組都顯著增加(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；模型組動(dòng)物錯(cuò)誤次數(shù)較正常組和假手術(shù)組顯著增多(P<0.05，P<0.05)，既濟(jì)湯治療組動(dòng)物的錯(cuò)誤次數(shù)較模型組有所減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表3)。

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal7.75±3.6943.13±19.73Sham8.63±3.4639.00±13.47Model7.13±4.0263.38±13.28**##JiJidecoction-treated19.13±10.66**##△△25.63±8.19*△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

Tab. 2 Effects of Jiji decoction on data of spatial probe test in mice with vascular dementia

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group

GroupEscapinglatency(s)Errorcountsin3minsNormal8.86±3.645.25±2.19Sham9.25±3.654.88±1.89Model4.88±2.108.63±3.46*#JiJidecoction-treated15.75±6.67**##△△6.13±3.27

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group

2.2 腦組織中SOD活性和MDA含量的測(cè)定

與正常組和假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中SOD活性顯著降低(P<0.01，P<0.01)、MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，既濟(jì)湯治療組小鼠腦組織中SOD活性和MDA含量明顯回落(P<0.01，P<0.01，表4)。

3 討論

VD是目前唯一一種可以預(yù)防和治療的癡呆類型。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)近年的理論研究提示，“心腎不交”在VD的發(fā)病中起著重要作用[6，7]。交泰丸是“交通心腎”的經(jīng)典方劑[8]。因此，本研究在交泰丸的基礎(chǔ)上加減組成既濟(jì)湯，改良后的方劑消炎抗菌成分降低，鎮(zhèn)靜催眠成分顯著提高，進(jìn)而觀察其對(duì)認(rèn)知行為的影響。腦缺血/再灌注損傷是目前通用的復(fù)制大鼠、小鼠VD模型的方法[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷小鼠出現(xiàn)顯著地認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為：小鼠在避暗實(shí)驗(yàn)或跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤潛伏期縮短、錯(cuò)誤次數(shù)增加；探索實(shí)驗(yàn)中小鼠到達(dá)暗室、高端和明室的時(shí)間顯著延長(zhǎng)。當(dāng)給予既濟(jì)湯連續(xù)14 d的治療后，VD小鼠的認(rèn)知功能障礙明顯改善。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，既濟(jì)湯治療組動(dòng)物在避暗實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)，探索實(shí)驗(yàn)中的爬高次數(shù)的表現(xiàn)都顯著優(yōu)于正常組。這些結(jié)果提示，既濟(jì)湯對(duì)正常動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能也有顯著地提高作用。因此，這些實(shí)驗(yàn)表明既濟(jì)湯以“交通心腎”為靶點(diǎn)能夠顯著改善VD的癡呆癥狀。

GroupSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)Normal3.80±0.3112.23±3.47Sham3.90±0.3111.03±3.64Model0.60±0.41**##28.66±6.89**##JiJidecoction-treated4.18±1.37△△15.33±7.27△△

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vssham group;

△△P<0.01vsmodel group

目前已有的報(bào)道表明，“交通心腎”對(duì)失眠、腸道預(yù)激綜合征、慢性腎功能不全、心腎綜合征等具有顯著地治療效果，但其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論基礎(chǔ)仍然不清楚，也未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)活性氧產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生超過(guò)內(nèi)源性的抗氧化防御機(jī)制的清除能力，進(jìn)而引起的氧化應(yīng)激，是VD發(fā)病的重要機(jī)制[10-12]。本研究所使用的方劑既濟(jì)湯中黃連[13]具有抗腦損傷的功效，益智仁[14]可以益智健腦，遠(yuǎn)志[15]具有抗癡呆和腦保護(hù)作用；黃連[16]、益智仁[17]、枸杞子[18]、菟絲子[19]、熟地[20]、遠(yuǎn)志[21]、黃芩[22]具有較強(qiáng)的抗氧化活性。那么既濟(jì)湯對(duì)VD的保護(hù)效應(yīng)是否與其緩解腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)？因此實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)了腦組織勻漿中SOD活性和MDA含量。結(jié)果顯示，VD模型組動(dòng)物腦組織勻漿中，SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；既濟(jì)湯治療組小鼠腦組織中SOD活性增加，MDA含量下降。這些數(shù)據(jù)表明，既濟(jì)湯對(duì)VD小鼠認(rèn)知行為的保護(hù)作用可能與其降低腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。因此從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)看，既濟(jì)湯“交通心腎”作用，可能與其對(duì)機(jī)體各個(gè)臟器氧化還原狀態(tài)的調(diào)整有關(guān)，但這一觀點(diǎn)需要進(jìn)一步的證據(jù)支持。中藥湯劑大多是混合性中藥成分，其作用靶點(diǎn)和機(jī)制遠(yuǎn)比單一化學(xué)藥物復(fù)雜，既濟(jì)湯抑制VD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激效應(yīng)，是通過(guò)減少ROS產(chǎn)生還是阻斷了其后的氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，尚需進(jìn)一步探討。

總之，本研究表明既濟(jì)湯可顯著改善VD小鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與其抑制腦內(nèi)的氧化應(yīng)激有關(guān)。今后，既濟(jì)湯有效成分、作用靶點(diǎn)和發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步闡明，將為相關(guān)疾病的防治提供新思路。

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Effects of Jiji decoction on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia induced by cerebral ischemia/reperfusion

LIU Feng-xi1, NIU Kai2, WU Zhi-gang1, XUE Gui-ping1, YANG Jian-ming1, ZHANG Dan-shen1△

(1. Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000; 2. Santa (Zhangjiakou) Pharmaceutical Co., LTD, Zhangjiakou 075000,China)

Objective: To determine the effects of Jiji decoction (Traditional Chinese Medicine) on the cognitive function and oxidative stress in mice with vascular dementia (VD) induced by cerebral ischemia/reperfusion. Methods: Thirty-two mice were randomly divided into normal group (n=8), sham group (operation, but no cerebral ischemia/reperfusion,n=8), model group (vascular dementia model induced by cerebral ischemia/reperfusion,n=8), and Jiji decoction- treated group (vascular dementia model plus treatment with Jiji decoction,n=8). Fourteen days of treatment after operation, the cognitive behavior was measured in step-through test, spatial probe test and platform test. Afterwards, to assess the levels of oxidative stress, the activity of superoxide dismutase(SOD) and content of malonaldehyde (MDA) in brain of these mice were measured. Results: Data from step-through test indicated that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged and the error counts were decreased significantly (P<0.01) compared with those of model group. Data from spatial probe test indicated that the time of entering darkroom, the time of climbing height and the time of entering bright room in Jiji decoction-treated group were shortened and the counts of climbing height were increased (P<0.05～0.01) significantly compared with those of model group. Data from platform test showed that the escaping latency of Jiji decoction- treated group was prolonged significantly (P<0.01) compared with that of model group. Compared with normal and sham group, the activity of SOD was decreased and the content of MDA was increased in model group significantly (P<0.01). Compared with those of model group, the levels of SOD and MDA in Jiji decoction- treated group were improved significantly (P<0.01). Conclusion: Jiji decoction could improve cognitive function of VD mice. Its mechanism might be related with the inhibition of oxidative stress in the brain.

Jiji decoction; vascular dementia; cognitive function; oxidative stress

河北省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(Z2011311)；張家口市科技局研究項(xiàng)目(1101090D)；河北北方學(xué)院校級(jí)青年基金項(xiàng)目(Q201131)

2014-09-24 【修回日期】2015-02-05

R364.1；R28

A

1000-6834(2015)02-170-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.020

△【通訊作者】Tel: 18931316068； E-mail: zhangjk1979@163.com