劉華聯(lián) ，江宏兵 ，承翼南 ，徐天舒 ，邢樹忠

（1常州市第一人民醫(yī)院口腔科，江蘇213001；2江蘇省口腔醫(yī)院·南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院）

作為一種非受體酪氨酸激酶，粘著斑激酶可通過多種信號(hào)分子通路在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷徙、血管生成等方面發(fā)揮重要作用[1-4]。我們通過前期對(duì)舌癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的病理分析發(fā)現(xiàn)，黏著斑激酶在頰、舌癌等口腔惡性腫瘤中高表達(dá)。且表達(dá)主要集中在腫瘤生長前沿區(qū)及轉(zhuǎn)移區(qū)癌細(xì)胞中，與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)以舌癌細(xì)胞Tca8113為研究對(duì)象，通過設(shè)計(jì)針對(duì)FAK的siRNA，下調(diào)舌癌細(xì)胞中FAK的表達(dá)，進(jìn)而觀察體外實(shí)驗(yàn)中FAK對(duì)舌癌細(xì)胞失巢凋亡及侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Tca8113舌癌細(xì)胞系由南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國invitrogen公司），鼠抗人FAK抗體、HRP標(biāo)IgG二抗、羊抗人β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋），G418（美國GIBCO公司），蛋白顯色試劑盒（美國PIERCE 公司），Poly-HEMA、Transwell小室（美國SIGMA公司）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設(shè)計(jì)合成及鑒定：此部分工作已在前期研究中完成，設(shè)計(jì)針對(duì)FAK的siRNA命名Tca-FAK，對(duì)照組命名為NON-siRNA[6]。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染及篩選：細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種約3×105個(gè)Tca8113細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)。100μL無血清無三抗的RPMI 1640培養(yǎng)的培養(yǎng)液溶解5μL LipofectamineTM2000和2μg質(zhì)粒DNA，然后將混合物加入Tca8113細(xì)胞中。在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，換入含10%新生牛血清的常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，改用含G418 400 mg/L的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。經(jīng)反復(fù)篩選2～3周后，收集具有G418抗性的細(xì)胞克隆增殖。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別命名為Tca-FAK、Tca-NON。未做任何處理的舌癌細(xì)胞命名為Tca8113。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法：將已消毒的玻片放置于培養(yǎng)皿中，密度為2×106/L的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中進(jìn)行爬片6小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，95%乙醇固定，過氧化酶阻斷劑30min、羊血清30min處理后加FAK單抗過夜。然后加入兔抗鼠IgG及SABC復(fù)合物，每個(gè)步驟間均以PBS（pH：7.14）輕微振洗。最后DAB顯色、脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗做為對(duì)照參考。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：常規(guī)收獲細(xì)胞，提取蛋白上樣，12mA 2h電泳，300mA、30～60min 轉(zhuǎn)膜。使用10%脫脂奶封閉，1∶2 00濃度鼠抗人FAK抗體 4℃條件下孵育24 h。PBS重復(fù)洗3次，加HRP標(biāo)IgG二抗，37℃下雜交1h，PBS重復(fù)洗6次，顯影定影并檢測膜上印跡。

1.2.5 懸浮培養(yǎng)：無水乙醇溶解poly-HEMA（10g/L），于6孔培養(yǎng)皿加3mL poly-HEMA溶解液。待乙醇揮發(fā)后，同樣方法和劑量加2遍poly-HEMA溶液，PBS清洗處理過的培養(yǎng)皿3遍備用。常規(guī)收獲貼壁細(xì)胞，以含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。然后每個(gè)培養(yǎng)孔中加入約1×106細(xì)胞，常規(guī)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)16小時(shí)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：將單細(xì)胞懸液加入2mL圓底離心管中離心，棄上清液。加入PBS 1mL離心洗滌1次，然后加入70%乙醇（預(yù)冷）5mL，4℃冰箱固定30分鐘。上機(jī)檢測前離心去乙醇，碘化丙啶染色15min。

1.2.7 劃痕試驗(yàn)：于6孔板培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，6小時(shí)后待細(xì)胞貼壁生長后，200μL滅菌吸樣槍頭細(xì)胞劃痕，在倒置顯微鏡下觀察機(jī)械劃并照相。48小時(shí)后，再次將培養(yǎng)皿在倒置顯微鏡，觀察劃痕并照相。每次照相在高倍鏡下選取5個(gè)視野，同時(shí)使用測微尺測量劃痕間隙的距離。

1.2.8 侵襲實(shí)驗(yàn)：于細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)將50μL 200mg/L的Matrigel加入Transwell小室內(nèi)，風(fēng)干后置于細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)備用。使用前用RPMI1640培養(yǎng)液清洗，選擇3孔，每孔分別加入100μL密度為2×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。將小室侵入24孔板含小牛血清1640培養(yǎng)基中，常規(guī)5%CO2、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，甲醇固定，龍膽紫染色及中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下選擇5個(gè)視野，計(jì)算透膜細(xì)胞總數(shù)。最后以透膜細(xì)胞的相對(duì)數(shù)來表示Tca8113細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.9 細(xì)胞活性檢測：收獲實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算出染色細(xì)胞，以此計(jì)算出細(xì)胞活性率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPASS統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，差異性比較采用t檢驗(yàn)和重復(fù)測量方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因沉默結(jié)果鑒定 激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染外源性質(zhì)粒后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞碎片增多。FAK siRNA和NON-siRNA質(zhì)粒因攜帶紅色熒光標(biāo)記和綠色熒光標(biāo)記。成功轉(zhuǎn)染后Tca-FAK組細(xì)胞中可見紅色熒光表達(dá)，Tca-NON中可見綠色熒光表達(dá)，表明外源性質(zhì)粒順利轉(zhuǎn)染入Tca8113細(xì)胞（圖1a，b）。免疫細(xì)胞化學(xué)（圖1c）及Western-blot（圖1e）結(jié)果顯示：Tca8113細(xì)胞中FAK表達(dá)為強(qiáng)陽性，外源性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Tca-FAK組FAK表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯下降，Tca-NON組細(xì)胞中FAK表達(dá)無明顯變化。表明RNAi成功實(shí)現(xiàn)FAK的下調(diào)（圖 1c，d，e）。

圖 1 基因沉默鑒定結(jié)果（a、b：400×；c、d：200×）

2.2 FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113增殖和凋亡影響 3組細(xì)胞在單層貼壁狀態(tài)下培養(yǎng)16小時(shí)后，細(xì)胞活力檢測及流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：Tca-FAK及Tca-NON組細(xì)胞的活力較Tca8113組細(xì)胞有輕微的下降，凋亡片段也有輕微的增加，但各組間數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞的增殖和凋亡無明顯影響。見表1。

表1 FAK基因沉默前后舌癌細(xì)胞活性及凋亡分析（xˉ±s，%）

圖2 FAK基因沉默促進(jìn)舌癌細(xì)胞Tca8113失巢凋亡

2.3 FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113遷移能力影響 細(xì)胞化痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：48小時(shí)后對(duì)照組（Tca-NON）細(xì)胞遷移距離為（0.91+0.05）mm，實(shí)驗(yàn)組（Tca-FAK）細(xì)胞遷移距離為（0.30+0.03）mm，腫瘤細(xì)胞遷移能力明顯降低（P<0.01），如圖3。

為了進(jìn)一步觀察FAK基因沉默對(duì)Tca8113失巢凋亡的影響，我們采用polyHEMA培養(yǎng)基剝奪細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)細(xì)胞懸浮生長。不同于貼壁培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞的單層生長方式，16小時(shí)后，顯微鏡下觀察到，Tca8113細(xì)胞及Tca-NON組細(xì)胞呈現(xiàn)集聚性生長的方式（圖2d，e），但Tca-FAK組細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯的集聚性生長狀態(tài)（圖2f）。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：Tca-FAK的凋亡片段顯著高于對(duì)照組及Tca8113組（P<0.01），表明FAK基因沉默可促進(jìn)舌癌細(xì)胞的失巢凋亡（圖2g）。

圖3 FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113遷移能力的影響

2.4 FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113侵襲能力影響 體外Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞侵襲透膜數(shù)為211.4+5.3個(gè)，而FAK基因沉默后的Tca8113細(xì)胞，侵襲能力明顯下降，僅為64.6+3.0（P<0.01）。見圖 4。

圖4 FAK基因沉默對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113侵襲能力影響

3 討 論

做為一種非受體酪氨酸激酶，粘著斑激酶可通過多種信號(hào)分子通路在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷徙、血管生成等方面發(fā)揮重要作用[1-4]。課題組人員前期通過對(duì)舌癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的病理分析發(fā)現(xiàn)：黏著斑激酶在頰、舌癌等口腔惡性腫瘤中高表達(dá)，且主要集中在腫瘤生長前沿區(qū)及轉(zhuǎn)移區(qū)癌細(xì)胞中，與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)[5]。

為了驗(yàn)證FAK在舌癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用，初期體外實(shí)驗(yàn)中，課題組成功構(gòu)建針對(duì)FAK的靶向RNA（small interfering RNA，siRNA）質(zhì)粒表達(dá)載體，免疫細(xì)胞化學(xué)及western-blot蛋白印跡檢測到舌癌細(xì)胞Tca8113中FAK表達(dá)明顯下調(diào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，課題組通過劃痕和Transwell小室侵襲試驗(yàn)來觀察FAK基因沉默前后舌癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FAK基因沉默后，Tca8113細(xì)胞的侵襲和遷移能力均得到明顯抑制（P<0.01），初步顯示FAK信號(hào)通路在舌癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用。

錨著依賴性生存（anchor-dependent survival）是正常實(shí)體組織細(xì)胞具有的特點(diǎn)之一，一旦在脫黏附狀態(tài)下就會(huì)發(fā)生凋亡，即失巢凋亡（anoikis）。發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞則具失巢凋亡抗性，即在脫黏附狀態(tài)下可以一種特殊的形式生存，這也是癌細(xì)胞可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制之一。目前已有學(xué)者通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)失巢凋亡抗性在口腔癌、胰腺腺癌等的轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵性的作用[3-4，7-8]。為驗(yàn)證FAK信號(hào)通路在舌癌細(xì)胞增殖及凋亡中作用，本實(shí)驗(yàn)第一階段在60mm培養(yǎng)皿上，將FAK基因干擾前后的細(xì)胞進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞活性檢測和流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，基因干擾前后舌癌細(xì)胞Tca8113的活性及凋亡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至于其中輕微的差異，筆者認(rèn)為可能是基因片段轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞后，因負(fù)荷增加而導(dǎo)致其活性及凋亡有輕微差異?？偨Y(jié)第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為單層貼壁培養(yǎng)狀態(tài)下，F(xiàn)AK信號(hào)通路改變對(duì)舌癌細(xì)胞的增殖和凋亡無明顯影響。第二階段，在相同條件下我們將基因沉默前后的細(xì)胞，在poly-HEMA處理過的60mm培養(yǎng)皿上進(jìn)行相同時(shí)間的懸浮培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀測量的凋亡結(jié)果顯示：懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下，F(xiàn)AK基因沉默后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)中我們有趣的發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞及Tca-NON組細(xì)胞呈現(xiàn)集聚性生長方式，但Tca-FAK組細(xì)胞并未出現(xiàn)這種集聚性生長。參考國內(nèi)外文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為FAK可能激活了包括MAPK、PI3K-Akt/PKB等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因失巢引起的源于細(xì)胞外基質(zhì)的生存信號(hào)進(jìn)而得到補(bǔ)償。癌細(xì)胞因具有失巢生存的能力，可在脫黏附狀態(tài)下生存，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。

綜上所述，我們認(rèn)為FAK基因沉默明顯增加Tca8113細(xì)胞的失巢凋亡能力，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的失巢凋亡抗性，降低了其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)FAK下游相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，探討其可能的分子途徑，以期為口腔癌的治療提供一種嶄新的思路。

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