胡　彬，曾秉輝，胡悅林，趙　強，景象一，張永玲，王一鳴△(中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，疾病基因組研究所，廣東廣州50080;廣州市婦女兒童醫(yī)療中心影像科，優(yōu)生圍產(chǎn)研究所，廣東廣州506)

一例罕見的新的TCIRG1基因雜合性突變引起的嬰兒惡性石骨癥*

胡彬1，2，曾秉輝1，2，胡悅林3，趙強1，2，景象一4，張永玲4，王一鳴1，2△
(中山大學1中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，2疾病基因組研究所，廣東廣州510080;廣州市婦女兒童醫(yī)療中心3影像科，4優(yōu)生圍產(chǎn)研究所，廣東廣州510623)

［摘要］目的:研究1例嬰兒惡性石骨癥患者的致病基因及其突變。TCIRG1和CLCN7是嬰兒惡性石骨癥最常見的致病基因。前者被認為是純合性致病基因，國外只有6例其雜合性改變也致本病的報導，而我國無雜合性突變導致本病的報道。方法:通過骨組織X線檢查結(jié)合臨床癥狀及體征確診1例散發(fā)性嬰兒惡性石骨癥患者。提取患者及其父母的外周血基因組DNA，PCR擴增TCIRG1和CLCN7基因外顯子及其剪切位點序列，對PCR產(chǎn)物直接測序。用TCRIG1基因附近的微衛(wèi)星標記和SNP構(gòu)建患者及其父母的單倍型。用染色體微陣列分析技術對患者及其母親進行TCIRG1基因拷貝數(shù)目變異的檢測。結(jié)果:患者TCIRG1基因第5號外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個4個堿基的缺失突變c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)，該突變使得基因3’端編碼的666個氨基酸被截斷，失去了整個ATP酶V0復合結(jié)構(gòu)域?；純弘p親TCIRG1和CLCN7基因的突變檢測及單倍體構(gòu)建證實該突變來源于患者父親。染色體微陣列分析未發(fā)現(xiàn)患兒及其母親攜帶有任何累及TCIRG1及CLCN7基因的拷貝數(shù)目變異。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了1例TCIRG1基因新的雜合性突變所致的嬰兒惡性石骨癥。這是我國TCIRG1基因雜合性突變引起嬰兒惡性石骨癥的首例報道。這個發(fā)現(xiàn)可用于嬰兒惡性石骨癥的分子診斷。

［關鍵詞］嬰兒惡性石骨癥; TCIRG1基因;缺失突變

嬰兒惡性石骨癥( infantile malignant osteopetrosis，IMO)是一種罕見的單基因遺傳性疾病，是石骨癥最嚴重的一種類型［1］。該病骨骼的異常表現(xiàn)為骨密度增高、病理性骨折、骨髓炎，其它臨床表現(xiàn)還有全血細胞減少、髓外造血、肝脾腫大、第II、VII、VIII對顱神經(jīng)受壓、腦積水、低鈣血癥等［2］。T細胞免疫調(diào)節(jié)子1( T-cell immune regulator 1，TCIRG1)和氯離子通道7( chloride channel 7，CLCN7)是最常見的致病基因［3-4］。TCIRG1基因編碼V型ATP酶116 kD同工型a3( V-ATPase 116 kD isoform a3)［5］，CLCN7基因編碼氯離子通道蛋白7( chloride channel protein 7，ClC-7)［6］。TCIRG1一般被認為只在純合性突變或復合雜合性突變時致病，但國外有3個學者報道了6例其雜合性突變所致石骨癥［7-9］。而在我國還未存在類似文獻。本研究對1例石骨癥患者進行TCIRG1基因突變篩查，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1研究對象

本研究中的石骨癥病人來自于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。本研究得到了患者及其家屬的知情同意和中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會的批準。

患者2歲時因摔傷到廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢查，確診為石骨癥。牙齒萌出障礙，至7歲時仍只萌出4顆牙齒。視力受損，眼底鏡檢查顯示視神經(jīng)萎縮。血常規(guī)顯示紅細胞計數(shù)為3. 29×1012/L(正常范圍3. 79×1012～5. 88×1012/L)，血紅蛋白濃度為77 g/L(正常范圍110～147 g/L)。腹部B超顯示肝脾腫大。腦電圖無明顯異常。

頭部CT及X線片(圖1)顯示顱骨廣泛硬化、增厚，板障間隙消失。全身X線片顯示脊柱椎體上下緣致密增厚，中間較稀疏，呈“夾心餅”樣改變。盆骨骨髓腔消失，呈現(xiàn)“骨中骨”的特殊表現(xiàn)。所攝諸長骨骨密度增高，骨髓腔消失，干骺端呈“燒瓶樣”改變。

2方法

2.1抽提基因組DNA取患者及其父母外周血3 mL，乙二胺四乙酸( ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，按天根血液基因組提取試劑盒操作指南提取DNA。

2.2引物設計和PCR從UCSC數(shù)據(jù)庫( http: / / genome.ucsc.edu)獲取TCIRG1和CLCN7基因序列，用Oligo 6. 0軟件分別設計10和16對引物，覆蓋所有編碼區(qū)域和剪切位點。這些引物由深圳華大基因研究院合成。PCR擴增反應體系為30 μL體系: 2× GCI緩沖液15 μL，2. 5 mmol/L dNTP混合物3 μL，LA Taq DNA聚合酶0. 3 μL，3. 2 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，滅菌水補足體積至30 μL。反應條件: 95℃3 min; 95℃30 s，58℃45 s，72 ℃1 min，40個循環(huán); 72℃10 min。

Figure 1.Radiological images of the patient.A，B: skull was generally sclerotic and the thickness increased; C，D: vertebral endplates was sclerotic and resulted in “sandwich vertebrae”appearance; E～G: the long bones showed the flask deformity and absence of bone marrow cavity; the bone marrow cavity of pelvis disappeared and showed“bone in bone”appearance.圖1　患者的影像學資料

2.3Sanger測序及突變鑒定在ABI 3730XL DNA測序儀上對PCR產(chǎn)物進行直接測序。測序結(jié)果用Sequence Scanner分析，并與UCSC數(shù)據(jù)庫基因參考序列比對，突變命名采用標準命名法( http: / /www.hgvs.org/mutnomen/)，+ 1代表翻譯起始密碼子ATG中的A。對檢測到的突變，用PCR法擴增父母相應的外顯子，并用直接測序法測序分析。

2.4基因分型及單倍體構(gòu)建我們對患者及其父母TCIRG1基因附近的微衛(wèi)星標記D11S987、D11S4162和D11S1314進行PCR擴增，并在ABI 3730XL DNA測序儀上進行基因型鑒定。在TCIRG1基因內(nèi)及其附近選取雜合度較高的SNP rs4147780、rs12273861、rs2075609和rs11481設計4對引物行PCR擴增，并用直接測序法鑒定其基因型。對rs7116924、rs3808974、rs10896289和rs11228127，則分別在第1、3、5和10對引物的測序結(jié)果中分析其基因型。根據(jù)所有基因型信息構(gòu)建單倍體。

2.5染色體微陣列分析我們用CytoScan 750K Array( Affymetrix)對患者及其母親進行染色體微陣列分析。我們根據(jù)Affymetrix的標準操作流程進行了DNA提取、擴增、片段化、標記和雜交。實驗結(jié)果用Chromosome Analysis Suite軟件進行分析。

結(jié)果

1 TCIRG1基因

患者TCIRG1基因直接測序結(jié)果顯示，第5個外顯子內(nèi)檢測到1個小的雜合缺失突變c.449 _ 452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)，見圖2。該突變使得開放閱讀框改變，在肽鏈第164位引入終止密碼子，使得3’端666個氨基酸被截斷，失去了整個ATP 酶V0復合結(jié)構(gòu)域，見圖3。由于該結(jié)構(gòu)域是V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白實現(xiàn)氫離子跨膜轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)基礎，因此可以預測患者的突變使該蛋白完全失去功能。對患兒雙親的突變檢測及單倍體構(gòu)建結(jié)果表明該突變遺傳自患者父親，見圖4。

Figure 2.Partial reverse sequence of the patient ( lower) and his mother ( upper).The c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) mutation of the patient was showed in the box.圖2　患者和其母親的部分反向測序圖

Figure 3.Prediction of the effect of c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) mutation.The mutation was predicted to wipe out 666 amino acids from the V-ATPase 116 kD isoform a3 protein.SP: signal peptide motif; CC: coiled-coil motif.圖3　c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)突變效果預測

2 CLCN7基因

對CLCN7基因的篩查未發(fā)現(xiàn)致病性突變。

3染色體微陣列分析

染色體微陣列分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)患者及其母親累及TCIRG1及CLCN7基因的拷貝數(shù)目變異( CNV，copy number variation)。

討論

TCIRG1基因及CLCN7基因是最常見的嬰兒惡性型石骨癥的致病基因，前者被認為是隱性基因。我們在患者中發(fā)現(xiàn)了TCIRG1基因的新的雜合性突變，而CLCN7基因未發(fā)現(xiàn)異常。這一新的TCIRG1基因突變c.449_452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)造成了氨基酸的移碼改變，并截斷了V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白，使其失去必不可少的ATP酶V0復合結(jié)構(gòu)域，因此是一個致病性突變。由于Sanger測序不能檢測拷貝數(shù)目變異［10-11］，因此我們對患者及其母親進行染色體微陣列分析。染色體微陣列研究結(jié)果排除了累及本基因的拷貝數(shù)目變異。這表明，本基因的雜合性突變也可能引起本病，這種雜合性突變致病的報道國外已有［7-9］，但在國內(nèi)為首例。

Figure 4.Pedigree of the family and haplotype analysis.Black bars depicted the disease-causing haplotypes.圖4　家系圖和單倍型分析

本文作者曾報道一例嬰兒惡性型石骨癥［12］，該患者由TCIRG1基因c.242delC( p.Pro81ArgfsX85)突變和c.1114C＞T( p.Gln372X)突變引起。其中c.242delC( p.Pro81ArgfsX85)突變與本文報道的c.449 _452delAGAG( p.Gln149Glnfs16)突變相似，也造成移碼突變，使V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白3’端666個氨基酸被截斷，使整個ATP酶V0復合結(jié)構(gòu)域丟失。其不同之處主要在于，本文報道的c.449_ 452delAGAG突變出現(xiàn)在卷曲螺旋( coiled coil)之后，沒有破壞卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)，而c.242delC突變出現(xiàn)在卷曲螺旋之前，破壞了卷曲螺旋。雖然本文報道的突變c.449_452delAGAG未影響卷曲螺旋，但由于該突變已經(jīng)使整個ATP酶V0復合結(jié)構(gòu)域丟失，因此即使突變蛋白仍有表達，也無法行使正常功能。

TCIRG1基因編碼的V型ATP酶116 kD同工型a3蛋白是破骨細胞吸收骨組織的結(jié)構(gòu)基礎。V型ATP酶可以在消耗ATP的同時向分泌性溶酶體泵入氫離子，之后，分泌性溶酶體被轉(zhuǎn)運到破骨細胞的骨組織面，與細胞膜融合，在破骨細胞和骨組織之間形成皺褶緣，并使皺褶緣和骨組織之間的液體酸化，促使骨組織被吸收［1］。當TCIRG1基因的突變使a3蛋白失去功能時，V型ATP酶失去轉(zhuǎn)運氫離子的功能，破骨細胞無法吸收骨組織。

破骨細胞吸收骨組織的功能喪失后，骨組織不能進行改建，骨髓腔消失，骨密度增加?；颊咚枨粌?nèi)造血功能受到不同程度的破壞，可表現(xiàn)為全血細胞減少，也可僅紅細胞減少。這促使髓外造血的發(fā)生，患者可表現(xiàn)為肝脾腫大。骨組織改建功能的喪失，也使得各出顱神經(jīng)孔狹窄，腦神經(jīng)受壓，患者可表現(xiàn)為視神經(jīng)損傷，聽力損傷。另外，由于牙齒的萌出需要相應的牙槽骨及時被吸收，因此石骨癥患者往往還有牙齒不能萌出的表現(xiàn)［2］。本研究中患者表現(xiàn)為骨密度增加，紅細胞減少，肝脾腫大，視神經(jīng)受壓，牙齒萌出障礙，可見本研究中患者的臨床表現(xiàn)是非常典型的。

我們對患者雙親TCIRG1基因的檢測及單倍體分析提示患者父親也攜帶這一致病性突變，但其表型完全正常，這一結(jié)果提示，本基因是否還有外顯不全的可能?造成外顯不全現(xiàn)象的原因非常復雜，修飾基因、等位基因的隨機表達、表觀遺傳學的修飾以及環(huán)境因素、患者的年齡、性別等因素都可在一定程度上影響疾病的外顯率［13］。這些影響基因突變效果的因素，在石骨癥另外一個基因CLCN7中得到了充分體現(xiàn)。CLCN7基因的突變可引起嬰兒惡性型、中間型、成人型石骨癥［4］。其中，嬰兒惡性型和中間型是由純合或復合雜合性突變造成的，成人型是由雜合性突變造成的，且成人型石骨癥存在外顯不全的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象使我們有理由推測，有某些修飾基因、表觀遺傳學修飾等因素，能使石骨癥的表型加重或減輕，甚至引起外顯不全的現(xiàn)象。因此，本研究中TCIRG1基因新突變c.449 _ 452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16)在家系中的外顯不全現(xiàn)象，也可能是通過這些機制產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究在1例嬰兒惡性型石骨癥患者TCIRG1基因中發(fā)現(xiàn)了一個新的雜合性突變，這是國內(nèi)第1例，國際上第7例由TCIRG1基因雜合性突變引起的石骨癥的報導。這為進一步揭示嬰兒惡性型石骨癥的發(fā)病機制提供了新的數(shù)據(jù)。

［參考文獻］

［1］Sobacchi C，Schulz A，Coxon FP，et al.Osteopetrosis: genetics，treatment and new insights into osteoclast function［J］.Nat Rev Endocrinol，2013，9( 9) : 522-536.

［2］Stark Z，Savarirayan R.Osteopetrosis［J］.Orphanet J Rare Dis，2009，4: 5.

［3］Scimeca JC，Quincey D，Parrinello H，et al.Novel mutations in the TCIRG1 gene encoding the a3 subunit of the vacuolar proton pump in patients affected by infantile malignant osteopetrosis［J］.Hum Mutat，2003，21( 2) : 151-157.

［4］Frattini A，Pangrazio A，Susani L，et al.Chloride channel ClCN7 mutations are responsible for severe recessive，dominant，and intermediate osteopetrosis［J］.J Bone Miner Res，2003，18( 10) : 1740-1747.

［5］Nishi T，F(xiàn)orgac M.The vacuolar ( H+) -ATPases: nature’s most versatile proton pumps［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3( 2) : 94-103.

［6］Kornak U，Kasper D，Bosl MR，et al.Loss of the ClC-7 chloride channel leads to osteopetrosis in mice and man ［J］.Cell，2001，104( 2) : 205-215.

［7］Wada K，Harada D，Michigami T，et al.A case of autosomal dominant osteopetrosis type II with a novel TCIRG1 gene mutation［J］.J Pediatr Endocrinol Metab，2013，26 ( 5-6) : 575-577.

［8］Kornak U，Schulz A，F(xiàn)riedrich W，et al.Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H+-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis［J］.Hum Mol Genet，2000，9( 13) : 2059-2063.

［9］Sobacchi C，F(xiàn)rattini A，Orchard P，et al.The mutational spectrum of human malignant autosomal recessive osteopetrosis［J］.Hum Mol Genet，2001，10( 17) : 1767-1773.

［10］鄧佳，鄧偉平，鐘誠，等.NF1基因新突變及我國首例NF1基因拷貝數(shù)目變異報道［J］.中國病理生理雜志，2013，29( 2) : 320-323.

［11］鄭靈燕，裴元元，李淼新，等.CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與慢性乙肝的易感性相關［J］.中國病理生理雜志，2011，27( 10) : 1951-1955.

［12］Yuan P，Yue Z，Sun L，et al.Novel mutation of TCIRG1 and clinical pictures of two infantile malignant osteopetrosis patients［J］.J Bone Miner Metab，2011，29( 2) : 251-256.

［13］Cooper DN，Krawczak M，Polychronakos C，et al.Where genotype is not predictive of phenotype: towards an understanding of the molecular basis of reduced penetrance in human inherited disease［J］.Hum Genet，2013，132 ( 10) : 1077-1130.

An unusual and novel heterozygous TCIRG1 mutation causes infantile malignant osteopetrosis

HU Bin1，2，ZENG Bing-hui1，2，HU Yue-lin3，ZHAO Qiang1，2，JING Xiang-yi4，ZHANG Yong-ling4，WANG Yi-ming1，2
(1Department of Medical Genetics，Zhongshan School of Medicine，2Institute of Disease Genomics，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;3Department of Radiology，4Department of Prenatal Diagnostic Center，Guangzhou Women and Children’s Medical Center，Guangzhou 510623，China.E-mail: ywzhong@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the underlying genetic changes of a Chinese patient with infantile malignant osteopetrosis ( IMO).IMO is a monogenic disease，mostly caused by mutations of TCIRG1 and CLCN7 genes.The former is believed a homozygous gene and only cause the disease in homozygous or compound heterozygous status.However，it has been reported that heterozygous mutations also cause the disease in 6 non-Chinese cases.METHODS: Genomic DNA was extracted from peripheral blood of the patient and his parents.All exons and splice sites of TCIRG1 and CLCN7 genes were amplified by PCR followed by Sanger sequencing.Mutation detection in the 2 genes was also investigated in the parents.Haplotypes were constructed by variations obtained in mutation detection and microsatillites flanking TCIRG1 gene in the family by Cyrillic.Chromosomal microarray analysis ( CMA) was performed to detect copy number variations ( CNV) of the patient and his mother.RESULTS: A novel mutation c.449_452delAGAG ( p.Gln149Glnfs16) was detected in the patient.This mutation truncated 666 amino acids at the C terminal of the V-ATPase 116 kD isoform a3 protein.It wiped out the entire ATPase V0 complex and was predicted to result in total loss of protein function.This mutation was also detected in the patient’s father.No pathogenic mutation was detected in CLCN7 gene.CMA did not reveal any CNV involving TCIRG1 or CLCN7 gene.CONCLUSION: We reported a novel heterozygous mutation of TCIRG1 gene causing IMO.This represents the first IMO case in China caused by heterozygous TCIRG1 gene mutation.

［KEY WORDS］Infantile malignant osteopetrosis; TCIRG1 gene; Deletion mutation

通訊作者△Tel: 020-87332055; E-mail: ywzhong@ hotmail.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目( No.31471193)

［收稿日期］2015-01-12［修回日期］2015-02-27

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1237-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.015