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        同源不同輻射抗拒NPC細胞間總甲基化水平及基因甲基化表達差異的探討*

        2015-05-16 00:50:56羅海丹王冬輝林偉達蘇箔金趙存友楊惠玲中山大學中山醫(yī)學院中山醫(yī)學院病理生理學教研室廣東廣州50080南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室廣東廣州5055
        中國病理生理雜志 2015年7期
        關鍵詞:鼻咽癌甲基化

        羅海丹,王冬輝,林偉達,蘇箔金,趙存友,楊惠玲△(中山大學中山醫(yī)學院,中山醫(yī)學院病理生理學教研室,廣東廣州50080;南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室,廣東廣州5055)

        同源不同輻射抗拒NPC細胞間總甲基化水平及基因甲基化表達差異的探討*

        羅海丹1,王冬輝2,林偉達1,蘇箔金2,趙存友3,楊惠玲2△
        (中山大學1中山醫(yī)學院,2中山醫(yī)學院病理生理學教研室,廣東廣州510080;3南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室,廣東廣州510515)

        [摘要]目的:比較同源不同輻射抗拒能力的鼻咽癌細胞CNE2R/CNE2間總甲基化水平及其區(qū)域的差異。方法:采用趙存友博士改良的基于甲基化敏感酶全基因組甲基化法檢測CNE2R/CNE2細胞全基因組甲基化水平;同時采用MeDIP-Seq測序法對CNE2R/CNE2細胞進行測序,分析比較DNA甲基化區(qū)域(主要包括6個基因功能元件即CDS、intron、downstream2k、upstream2k、3’UTR及5’UTR)的差異。結(jié)果: CNE2R細胞全基因組甲基化水平比CNE2細胞低約30%;在CNE2R和CNE2細胞中,雖然分布在6個基因功能元件上的峰值個數(shù)和峰值在各基因元件上的覆蓋度均無明顯差異,但2種細胞的6個基因功能元件上基因甲基化存在差異。結(jié)論:同源不同輻射抗拒能力的鼻咽癌細胞間總甲基化水平及基因甲基化存在差異,推測DNA甲基化的差異可能與鼻咽癌輻射抗拒相關。

        [關鍵詞]輻射抗拒;甲基化;鼻咽癌;基因元件

        目前放療仍為鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC)的首選療法,但是放療引發(fā)的輻射抗拒嚴重制約NPC病人5年生存率的提高[1],而NPC輻射抗拒機制至今尚未闡明。近年表觀遺傳調(diào)控特別是DNA甲基化因其作用位點廣泛且調(diào)控結(jié)果可逆等特性而備受關注,已有研究報道DNA甲基化與腫瘤的放化療抗拒相關,如Chen等[2]定量MSP檢測發(fā)現(xiàn)頭頸部腫瘤病人組織NEFL啟動子CpG島的超甲基化與順鉑治療耐受正相關,而影響病人存活時間; Luzhna等[3]報道MCF-7/DOX細胞輻射抗拒與全基因組顯著低甲基化相關。另外有研究提示NPC是一種高頻率基因CpG島甲基化的腫瘤[4-5],至于NPC輻射抗拒時細胞DNA甲基化變化如何值得深入探討。本研究擬采用Zhao等[6]改良的基于甲基化敏感酶全基因組甲基化法和MeDIP-Seq測序法檢測和比較NPC輻射抗拒細胞CNE2R和NPC輻射敏感細胞CNE2[7]的全基因組甲基化水平及甲基化區(qū)域(主要為6個基因功能元件即CDS、intron、downstream2k、upstream2k、3’UTR及5’UTR)的差異,為闡明NPC輻射抗拒機制、確立預測和逆轉(zhuǎn)NPC輻射抗拒新標記物和靶點提供實驗依據(jù)。

        材料和方法

        1實驗材料

        人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2由中山大學腫瘤防治中心院提供,CNE2R細胞是本實驗室在CNE2細胞基礎上采用爬坡式放療誘導生成的對放療抵抗的細胞株。

        Paired-End DNA Sample Prep kit購自Illumina; agnetic甲基化DNA免疫沉淀反應設備購自Diagenod; Covaris sonication system超聲波反應器為Covaris產(chǎn)品; PCR Thermal Cycler基因擴增儀為ABI產(chǎn)品; NanoDrop 1000分光光度計為Thermo產(chǎn)品; Agilent 2100生物分析儀為Agilent產(chǎn)品;恒溫均勻器和離心機為Eppendorf產(chǎn)品; Qubit核酸/蛋白定量系統(tǒng)為Invitrogen產(chǎn)品。

        2方法

        2.1細胞培養(yǎng)胰酶消化對數(shù)生長期的CNE-2R和CNE-2細胞,用含10%滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細胞為2×108cells/L的細胞懸液,接種于10 mL的培養(yǎng)皿,每皿2×106個,并置于37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        2.2CNE2R/CNE2細胞基因組DNA的制備和提取

        培養(yǎng)48 h后棄上清,用PBS洗2次,每皿加1 mL

        TRIzol使細胞裂解,轉(zhuǎn)移至微量離心管中,加入200 μL PBS,吹打重懸。隨后清除RNA,加入4 μL 100 g/L RNase A,旋渦混勻后室溫放置2 min;再加入20 μL蛋白酶K,旋渦混勻;加入200 μL樣品裂解液B,旋渦混勻后70℃孵育10 min。加入200 μL無水乙醇,旋渦混勻后將所得混合物加入到DNA純化柱內(nèi),6 000×g離心1 min。棄廢液收集管內(nèi)液體,加入500 μL洗滌液I,6 000×g離心1 min。棄廢液收集管內(nèi)液體。加入600 μL洗滌液II,18 000×g離心1 min。棄廢液,收集管內(nèi)液體。進行以上離心步驟前需將純化柱置于廢液收集管上,棄廢液后回收廢液收集管。18 000×g離心1 min,以去除殘留的乙醇。將DNA純化柱置于一潔凈的1.5 mL離心管上,加入50~200 μL洗脫液。室溫放置1~3 min。18 000×g離心1 min,所得液體即為純化得到的總DNA。洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央,使液體被純化柱吸收。對提取的DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

        2.3檢測CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平-FPDM鑒定對甲基化敏感的Hpa II核酸內(nèi)切酶和對甲基化不敏感的Msp I核酸內(nèi)切酶是同切酶,具有相同的靶序列CCGG,在酶切產(chǎn)生的5’端生成1 個CpG的突出序列,可作為互補鏈擴增的模板。分別取50~500 ng CNE2R/CNE2細胞DNA樣本置于50 μL的混合溶液中進行酶切反應。混合溶液中包含1×107U/g Hpa II或Msp I DNA、1×buffer( 33 mmol/L三羥基氨甲烷醋酸鹽、10 mmol/L醋酸鎂、66 mmol/L乙酸鉀和0. 5 mmol/L二硫蘇糖醇)和0. 01% BSA,37℃保溫12 h( CNE2R/CNE2細胞基因組DNA)。將酶切產(chǎn)生的DNA與DNA聚合酶及TAMRA-dCTP混合,在每條鏈上將添加1個TAMRA-dCMP,即每個酶切位點增添2個TAMRA-dCTP。取10 μL酶切的DNA置于1個含15 μL增鏈反應溶液的384孔的培養(yǎng)皿中。溶液包含1×PCR buffer,0. 75 U Taq DNA聚合酶( TaKaRa),0.56 nmol熒光TAMRA-dCTP。在57.8℃恒溫箱中靜置1 h。其中,Msp I核酸內(nèi)切酶能識別甲基化的Cm5CGG序列而Hpa II核酸內(nèi)切酶無法識別,因此,當該CCGG酶切位點中的CpG二核苷酸被甲基化時,Cm5CGG序列僅能被Msp I核酸內(nèi)切酶識別并進行切割。使用Wallac VictorTM2V 1420多標記分析儀( PerkinElmer)通過FP對每孔中與DNA結(jié)合的TAMRA-dCMP進行測量,對擴增的DNA無需提純。對空白FP閱讀框進行校正,Hpa II和Msp I處理的樣品的FP閱讀框產(chǎn)生的甲基化的范圍:甲基化( %) = ( 1-Hpa II/Msp I)×100%,其中Hpa II/Msp I代表Hpa II誘導的TAMRA-dCMP結(jié)合物與Msp I誘導的TAMRA-dCMP結(jié)合物校正后的空白FP閱讀框的比值。

        2.4MeDIP-Seq測序采用Diagenod公司的agnetic甲基化DNA免疫沉淀反應設備對基因組DNA進行甲基化處理,用Covaris sonication system超聲波反應器將基因組DNA超聲打斷至100~500 bp片段,DNA片段末端修復、3’端加A堿基,連接測序接頭,雙鏈DNA變性成單鏈DNA。采用5-mC抗體對基因組進行沉淀富集,QPCR對抗體富集結(jié)果進行驗證。PCR擴增后跑膠,切膠純化,進行DNA片段大小選擇,切取220~320 bp的片段回收,并用Agilent 2100 Analyzer定量,合格的文庫行上機測序。將測序結(jié)果與參考基因組比對,比對上唯一位置的序列用于后續(xù)標準信息分析及個性化分析。

        3統(tǒng)計學處理

        統(tǒng)計MeDIP-Seq數(shù)據(jù)富集區(qū)域( Peak)在不同基因功能元件上的分布和差異,應用華大基因工程自制軟件分別統(tǒng)計Peak在upstream2k、5’UTR、CDS、Intron、3’UTR、downstream2k等6個基因功能元件上的個數(shù)分布和覆蓋度分布。同時比較peak在不同基因功能元件上分布的差異。

        結(jié)果

        1CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平

        通過對提取的DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測獲得電泳條帶,結(jié)果表明條帶單一,純度較高,可用于進一步實驗。隨后采用Zhao等[6]改良的新方法對CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平進行測定,獲得CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平如圖1所示。結(jié)果顯示CNE2R細胞的全基因組甲基化水平與CNE2細胞相比大約下降30%,2者存在顯著差異。

        Figure 1.The genome-wide methylation levels of DNA in the CNE-2 cells and CNE-2R cells.*P<0. 05 vs CNE-2.圖1 CNE-2和CNE-2R細胞DNA全基因組甲基化水平

        26個基因功能元件上的峰值( peak)個數(shù)及覆蓋度比較

        計算CNE-2R和CNE-2細胞分布在upstream2k、5’UTR、CDS、intron、3’UTR、downstream2k等6個基因功能元件上的peak相關基因個數(shù)及覆蓋度和差異見圖2、3。結(jié)果表明CNE2R/CNE2兩細胞株的基因組在upstream2k、5’UTR、CDS、intron、3’UTR、downstream2k等6個基因功能元件上的peak個數(shù)及覆蓋度無明顯差異。

        Figure 2.The numbers of peak in each gene function element of the DNA isolated from CNE-2 cells and CNE-2R cells.圖2 分布在CNE-2和CNE-2R細胞各個元件上的peak個數(shù)

        Figure 3.The coverage of the peak in each gene function element of the DNA isolated from CNE-2 cells and CNE-2R cells.圖3 Peak在CNE-2和CNE-2R細胞中各基因元件上的覆蓋度

        3分析CNE-2R和CNE-2細胞間的peak相關差異基因

        將2個樣本的peak區(qū)域合并,統(tǒng)計合并后的區(qū)域中每個樣品歸一化后的reads個數(shù)并做χ2檢驗。根據(jù)區(qū)域內(nèi)reads數(shù)的差異,我們將差異區(qū)域分為上升和下降2種趨勢差異區(qū)域,如同一peak區(qū)域內(nèi)CNE-2R的reads數(shù)高于CNE-2的基因即為up,反之為down。篩選條件為P<0. 01,2個樣本在相同基因元件內(nèi)均覆蓋,且覆蓋度的差異在2倍以上。結(jié)果表明CNE-2R和CNE-2細胞在6個基因功能元件上基因甲基化表達存在差異。CNE-2R和CNE-2細胞各基因功能元件上甲基化水平改變的基因個數(shù)存在差異,而差異基因個數(shù)差異不明顯,見圖4。

        Figure 4.The numbers of genes altered on methylation in each gene function element in the CNE-2 cells and CNE-2R cells.圖4 CNE-2和CNE-2R細胞各基因功能元件上甲基化水平改變的基因個數(shù)

        討論

        目前制約鼻咽癌生存率的主要是輻射抗拒,故闡明NPC輻射抗拒機制并逆轉(zhuǎn)輻射抗拒尤為迫切。表觀遺傳學包括DNA甲基化、microRNA、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼RNA調(diào)控等,近年來表觀遺傳學尤其是DNA甲基化與腫瘤的相關研究備受關注。已有研究表明DNA甲基化與腫瘤的放化療抗拒相關,如Zhou等[8]證實惡性膠質(zhì)瘤中SOCS1超甲基化致其表達減少,通過ERK-MAPK信號通路介導放療抵抗;在口腔鱗狀細胞癌中放療可提高RASSF1A/RASSF2A甲基化水平,激活Ras相關通路而誘導放療抵抗[9];張曉偉[10]通過實驗表明DNA甲基化水平與紫杉醇耐藥形成密切相關,DNA異常甲基化后的耐藥相關基因表達改變導致腫瘤耐藥的形成。但尚未見全基因組甲基化水平異常與腫瘤輻射抗拒的相關報道。

        本研究采用Zhao等[6]改良的基于甲基化敏感酶全基因組甲基化法對CNE-2R與CNE-2細胞全基因組甲基化水平進行檢測和比較,該法步驟較為簡便,且可直接在多孔培養(yǎng)皿中對亞微克劑量的DNA進行測量,更適用于生物和臨床實驗中高通量、多樣本的測定需要。檢測結(jié)果顯示CNE2R細胞全基因組甲基化水平與CNE2細胞的相比大約低30%,表明輻射抗拒差異的細胞間全基因甲基化水平存在差異,推測該差異可能與細胞輻射抗拒差異相關。

        同時,我們采用MeDIP-Seq測序法對CNE2R/ CNE2細胞進行測序,驗證CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平及差異,并分析比較DNA甲基化區(qū)域的差異,其中主要6個基因功能元件包括CDS、intron、downstream2k、upstream2k、3’UTR及5’UTR。結(jié)果表明CNE2R/CNE2兩細胞株基因組在upstream2k、5’UTR、CDS、intron、3’UTR、downstream2k 等6個基因功能元件上的peak個數(shù)及覆蓋度無明顯差異,與CNE2R/CNE2細胞的全基因組甲基化水平存在的差異不相符。這可能與本方法的局限性有關,MeDIP-Seq測序法測序時主要針對以上6個基因功能元件,顯示結(jié)果僅代表6個基因功能元件的甲基化差異,而非全基因組內(nèi)所有基因甲基化的差異。如何克服這一局限性,定位到具體甲基化基因的差異也是我們今后研究的重點。另外,MeDIP-Seq測序法測得6個基因功能元件上的peak個數(shù)及覆蓋度為各個功能元件的整體水平,通過分析CNE-2R和CNE-2細胞間的peak相關差異基因和差異,結(jié)果表明6個基因功能元件上基因甲基化表達存在上調(diào)和下調(diào)差異,但上調(diào)和下調(diào)基因的個數(shù)大致接近,因此可能在各個功能元件表現(xiàn)為無差異。

        本研究各項結(jié)果表明同源不同輻射抗拒NPC細胞間總甲基化水平及基因甲基化表達存在差異,推測DNA甲基化的差異可能與鼻咽癌輻射抗拒相關。然而,DNA甲基化與NPC輻射抗拒之間是否存在相關關系,特別是尋找某基因的甲基化水平與NPC輻射抗拒相關的作用位點及相關通路仍需要深入探討。

        [參考文獻]

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        [10]張曉偉.DNA甲基化在鼻咽癌紫杉醇耐藥形成及逆轉(zhuǎn)耐藥機制中的初步研究[D].湖南:中南大學,2012.

        Differences of genome-wide methylation level and methylated genes between nasopharyngeal carcinoma cells in same genetic background but different radiation resistance

        LUO Hai-dan1,WANG Dong-hui2,LIN Wei-da1,SU Bo-jin2,ZHAO Cun-you3,YANG Hui-ling2
        (1Zhongshan School of Medicine,2Department of Pathophysiology,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China;3Department of Medical Genetics,School of Basic Medical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China.E-mail: yanghl@ mail.sysu.edu.cn)

        [ABSTRACT]AIM: To compare the differences of the genome-wide methylation levels and methylated regions between nasopharyngeal carcinoma ( NPC) cells in the same genetic background but different radiation resistance ( CNE-2 cells and CNE-2R cells).METHODS: Using the method which was developed by Doctor Zhao Cun-you,based on using methyl-sensitive restriction enzyme to measure the genome-wide methylation levels.In addition,MeDIP-Seq was used to analyze the methylated regions in 6 gene functional elements,including the upstream 2k sequence,5’UTR,coding sequence,intron,3’UTR and downstream 2k sequence,between CNE-2 cells and CNE-2R cells.RESULTS: The genomewide methylation level was approximately 30% lower in CNE-2R cells than that in CNE-2 cells.No obvious difference on the amount of genes and the coverage of the peak in the 6 gene functional elements was observed.However,the methylation pattern of plentiful genes had altered in the gene function elements.CONCLUSION: The genome-wide methylation levels and methylated regions between NPC cells in the same genetic background but different radiation resistance were quite different,indicating that the DNA methylation may be associated with NPC radioresistance.

        [KEY WORDS]Radiation resistant; Methylation; Nasopharyngeal carcinoma; Gene element

        通訊作者△Tel: 020-87332268; E-mail: yanghl@ mail.sysu.edu.cn

        *[基金項目]國家自然科學基金資助項目( No.81071837; No.81372410) ;廣東省自然科學基金重點項目( No.92510089; No.01000005) ;國家大學生創(chuàng)新訓練計劃項目( No.201310558074; No.201210558076) ;廣東省大學生創(chuàng)新訓練項目( No.1055813171)

        [收稿日期]2014-12-15[修回日期]2015-02-04

        [文章編號]1000-4718( 2015)07-1300-05

        [中圖分類號]R363. 1+21

        [文獻標志碼]A

        doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.026

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