邢幫榮，陳郁鮮，曾　花，楊曉燕，梁彩倩，周偉雄，孔慶磊，韓建華，張永標△(中山大學附屬第三醫(yī)院急診科，骨科，廣東廣州50630)

Decorin對僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞增殖及I型膠原蛋白表達的影響*

邢幫榮1，陳郁鮮2，曾花1，楊曉燕1，梁彩倩1，周偉雄1，孔慶磊1，韓建華1，張永標1△
(中山大學附屬第三醫(yī)院1急診科，2骨科，廣東廣州510630)

［摘要］目的:探討重組核心蛋白聚糖( decorin)對人僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞的增殖和Ⅰ型前膠原蛋白( PcⅠ) mRNA表達及Ⅰ型膠原蛋白( ColⅠ)合成的影響，為decorin治療人膝關節(jié)僵直提供理論依據。方法:分離培養(yǎng)人僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞，分別加入不同濃度( 0.1、5和10 mg/L)的decorin;培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用MTT法測定關節(jié)滑膜B型細胞的活力;用流式細胞術檢測滑膜B型細胞的周期和凋亡; RT-PCR法檢測滑膜B型細胞的PcⅠmRNA表達; Western blot檢測ColⅠ的合成。結果: 5和10 mg/L的decorin可有效降低滑膜B型細胞的活力( P＜0.05)，明顯增加處于G0/G1期細胞的百分比( P＜0.05)，并下調PcⅠmRNA的表達，抑制ColⅠ的合成;同時實驗組和對照組均未檢測到終末期凋亡細胞。結論: Decorin可抑制人僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞的增殖、PcⅠmRNA的表達和ColⅠ的合成，在防治膝關節(jié)僵直中可能起一定的作用。

［關鍵詞］膝關節(jié)僵直;滑膜B型細胞;核心蛋白聚糖; I型膠原蛋白

研究表明膝關節(jié)滑膜B型細胞即關節(jié)滑膜成纖維細胞樣滑膜細胞( fibroblast-like synoviocytes，FLC)的大量增殖、膠原蛋白等細胞外基質的大量沉積是導致創(chuàng)傷后膝關節(jié)僵直的重要病因之一［1］，而這些都與轉化生長因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)密切相關。核心蛋白聚糖( decorin)作為TGF-β的天然抑制因子，可調節(jié)細胞黏附、遷移、增殖和膠原纖維的形成，抑制纖維化粘連［2］。我們選擇創(chuàng)傷后膝關節(jié)僵直的關節(jié)滑膜B型細胞作為研究對象，用不同濃度decorin作用于實驗組和對照組關節(jié)滑膜B型細胞。在細胞水平上探討TGF-β拮抗劑decorin在體外抑制創(chuàng)傷后膝關節(jié)囊纖維瘢痕增生的作用及機制，為decorin治療創(chuàng)傷后膝關節(jié)僵直提供理論依據。

材料和方法

1主要試劑及儀器

Decorin( Sigma) ; DMEM干粉培養(yǎng)基和胰酶干粉劑( Gibco) ;小牛血清(杭州四季青) ;Ⅰ型膠原蛋白( collagen type I，Col I)抗體( Chemicon) ; RT試劑盒( MBI Fermentas) ; DRR034A PCR試劑盒和DL2000 DNA Marker( TaKaRa) ;Ⅰ型前膠原蛋白( procollagen typeⅠ，PcⅠ)的引物(上游引物5’-TCCAAAGGAGAGAGCGGTAA-3’，下游引物5’-GACCAGGGAGACCAAACTCA-3’，片段長度693 bp)和內參照三磷酸甘油脫氫酶( glycerol-3-phosphate，GAPDH)的引物(上游引物5’-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3’，下游引物5’-CGGCCATCGCCACAGTTT-3’，片段長度300 bp)由上海博亞生物工程有限公司合成; TRIzol試劑盒( Gibco) ;逆轉錄試劑盒( TaKaRa) ; GeneGnome圖像分析系統(tǒng)( Gene) ; Western blot試劑盒( Promega)。

2實驗分組及關節(jié)滑膜B型細胞的處理

實驗用滑膜B型細胞采用滑膜組織塊(取自中山大學附屬第三醫(yī)院骨科關節(jié)鏡手術后標本，病人知情并同意捐獻)培養(yǎng)法，為第3～4代細胞;實驗共分為4組，對照組(只加DMEM)以及0.1 mg/L、5 mg/L和10 mg/L decorin組;將滑膜B型細胞以每孔2×103接種于6孔板中，待48 h細胞鋪滿板底80%時，改換成含10%胎牛血清的dMEM培養(yǎng)基。依次分別加入對應濃度的decorin。上述各組分別作用24 h、48 h、72 h后，終止培養(yǎng);收集各組細胞備用。

3MTT法測定細胞活力

將滑膜B型細胞用2.5 g/L胰酶消化脫壁，用含10%小牛血清的DMEM調整細胞密度為2×107/L，接種96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內孵育10 h，倒置顯微鏡下觀察細胞單層鋪滿孔底的80%時，分別加入對應濃度的decorin，每個濃度的decorin組設6個復孔，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內分別孵育24 h、48 h和72 h后，每孔加入0.5 %MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞中見藍紫色細針狀結晶形成。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，鏡下觀察見結晶完全溶解。同時設置調零組(只含培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照組(只含細胞、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。用酶聯免疫檢測儀于490nm處測量各孔的吸光度。

4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

收集第3代細胞，用含10%小牛血清的DMEM調整細胞密度為1×109/L，取1 mL細胞懸液接種于6孔板內。置37℃、5 % CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入對應濃度的decorin，每組設立4個復孔。置37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后終止。用2.5 g/L的胰酶消化并離心( 800 r/min)收集細胞，PBS洗滌2次，棄上清，加入100 mg/L RNase A，37℃水浴并振蕩15 min以去除RNA，加入500 μL PBS含50 mg/L溴化乙錠( PI)，4℃避光孵育20 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，汞激發(fā)波長488 nm，計數8 000個細胞，結果用Lysis軟件分析細胞周期和細胞凋亡。

科室之間或者同事之間,可以直接溝通解決的問題,非要上報護士長甚至護理部來間接溝通,影響同事間的友誼,降低工作效率,影響工作氣氛。

5RT-PCR法檢測PcⅠmRNA的表達

5.1提取細胞總RNA分別取不同濃度的decorin作用后24 h、48 h和72 h的實驗組、對照組的細胞，各組每個時相點設3個復孔。以TRIzol法提取細胞總RNA(按試劑盒說明書進行)，－70℃保存。

5.2逆轉錄制備cDNA按逆轉錄試劑盒操作手冊進行操作。每個樣品取500 ng總RNA、Ⅰ型膠原蛋白和GAPDH的下游引物各0.5 μL，總體積10 μL逆轉錄成cDNA;反應條件: 30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。

5.3PCR擴增PcⅠ和GAPDH的產物取逆轉錄產物10 μL，PcⅠ和GAPDH的上、下游引物各0.5 μL，總體積50 μL進行PCR反應;反應條件: 94℃預變性2 min;然后94℃30s，55℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)。PCR產物分裝，－20℃保存。

5.4電泳鑒定每個樣品取5 μL PCR產物與1 μL上樣緩沖液混合上樣，以2%瓊脂糖凝膠，100 V電泳45 min，進行PCR產物鑒定，反射紫外燈下用GeneGnome圖像分析系統(tǒng)掃描分析，mRNA相對含量用其PCR產物與GAPDH吸光度×面積的比值表示。

6Western blot檢測ColⅠ的表達

6.1總蛋白制備不同濃度的decorin作用B型細胞24 h、48 h和72 h后，每個時點收集細胞，提取細胞蛋白，－70℃條件下保存，備齊標本。

6.2 Western blot檢測Ⅰ型膠原蛋白表達聚丙烯酰胺凝膠電泳采用40 g/L濃縮膠、120 g/L分離膠，上樣量60 μg，電壓80 V待蛋白跑出濃縮膠后調致180 V，電泳結束后取出凝膠，用夾心方法把濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、濾紙依順序放好，然后用海綿布、篩孔板固定好，插入電轉移槽中，并加入電轉移緩沖液，保證凝膠在陰極，硝酸纖維素薄膜在陽極方向。放入轉移槽中，100 V電壓下轉膜100 min，取出硝酸纖維素薄膜置入20g/L牛血清白蛋白/PBST液中37℃封閉2 h。加入Ⅰ型膠原的Ⅰ抗，4℃冰箱過夜。Ⅰ型膠原Ⅰ抗為鼠抗人Ⅰ型膠原抗體，稀釋度為1∶1 500;Ⅱ抗: EnVisionTMPeroxidase Rabbit，稀釋度為1∶2 000。次日漂洗硝酸纖維素薄膜3次，每次5 min，再加入適當稀釋的Ⅱ抗，室溫2 h，取出再次漂洗3次，每次5 min，用ECL發(fā)光液涂抹于硝酸纖維素薄膜上，反應5 min;吸干膜表面液體，用塑料保鮮膜包裹后固定于壓片匣中，曝光顯影。實驗組和對照組每個時相點均取3個蛋白樣本進行檢測。將X射線膠片置于圖像分析系統(tǒng)。測定目的條帶的平均吸光度值，并將3次實驗結果的平均值作為Ⅰ型膠原蛋白含量的相對值。

實驗數據用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數據以均數±標準差( mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Decorin對僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞活力的影響

0.1mg/L decorin組與對照組比較，在各個時點的滑膜B型細胞活力雖然有降低，但差異無統(tǒng)計學意義; 5 mg/L組和10 mg/L decorin組在各時間點與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)，見表1。

表1　Decorin作用不同時間后對膝關節(jié)滑膜B型細胞活力的影響Table 1.The MTT values of FLC treated with decorin ( Mean± SD.n =6)

2 不同濃度decorin對僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞周期和凋亡的影響

在每個時點與對照組比較，0. 1 mg/L decorin組G0/G1期細胞比率增多不明顯，而5、10 mg/L組的G0/G1期細胞比率顯著增多( P＜0.05)，表明5、10 mg/L組靜止期細胞顯著增多;與對照組比較，0. 1 mg/L組G2/M + S期細胞比率無明顯改變，而5、10 mg/L組G2/M + S期細胞比率顯著減少( P＜0.05)。所有實驗組和對照組均未檢測到終末凋亡細胞，見表2。

3 RT-PCR法檢測PcⅠmRNA的表達

每個時點隨著decorin的濃度增加，PcⅠmRNA表達量明顯降低，5 mg/L和10 mg/L組的PcⅠmRNA表達量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義( P＜0. 05)，而0.1 mg/L組的PcⅠmRNA表達量與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖1。

表2　Decorin作用滑膜B型細胞后，細胞周期中各期細胞的比率Table 2.The flow cytometry results of FLC treated with decorin( %.Mean±SD.n =4)

4 Western blot檢測I型膠原蛋白的表達

每個時點隨著decorin濃度增高，條帶密度降低。5 mg/L和10 mg/L decorin組與對照組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達量的差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05) ; 0. 1 mg/L decorin組與對照組比較，Ⅰ型膠原蛋白表達量的差異沒有統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 1.RT－PCR results for Pc I mRNA expression in FLC.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control group.圖1　RT-PCR法檢測關節(jié)滑膜B型細胞Ⅰ型前膠原蛋白mRNA的表達

Figure 2.Western blot results of collagen type I ( Col I) protein expression in FLC treated with decorin for 24 h，48 h and 72 h.Mean ±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control group.圖2　不同濃度decorin作用關節(jié)滑膜B型細胞24 h、48 h和72 h后Ⅰ型膠原蛋白的表達

討論

損傷后膝關節(jié)滑膜B型細胞的激活，滑膜B型細胞大量增殖與凋亡抑制以及I型膠原蛋白等細胞外基質( extracellular matrix，ECM)的大量沉積是導致關節(jié)僵硬最重要的原因［3］，最終膝關節(jié)滑膜囊纖維瘢痕形成;雖然有許多細胞生長因子都參與了成纖維細胞的激活過程，以及瘢痕纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展，但已有研究表明TGF-β起到了關鍵的作用［4］;據此推測TGF-β的天然拮抗劑decorin可能抑制創(chuàng)傷后僵直膝關節(jié)囊纖維瘢痕的形成，相關研究國內尚未見報道。本研究利用不同濃度decorin作用體外培養(yǎng)的僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞，從細胞和蛋白水平證實decorin能有效抑制僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞的活力和Ⅰ型膠原蛋白的合成，因此推測其有可能抑制僵直膝關節(jié)囊纖維瘢痕的形成，為創(chuàng)傷后膝關節(jié)僵直的治療提供了一個新的靶點和方法，并為進一步利用decorin治療創(chuàng)傷后膝關節(jié)僵直提供了實驗基礎。

Decorin是一種小分子的硫酸軟骨素類蛋白多糖，廣泛分布于人和動物的皮膚、肌腱、骨、軟骨、韌帶等部位的結締組織中，具有抗纖維化及抑制細胞生長的兩大特性［5］。作為體內自身正常的TGF-β調節(jié)因子，decorin能夠調節(jié)細胞黏附、遷移、增殖和I型膠原纖維的形成，起著生理狀態(tài)下的抑制纖維化粘連的作用［6］;研究表明一定劑量的decorin能抑制靶組織的纖維化［7］。本實驗通過MTT法測得不同濃度的decorin對人僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞的活力有不同影響，在每個時點，低濃度的decorin( 0.1 mg/L)抑制關節(jié)滑膜B型細胞活力作用不明顯;而高濃度( 5 mg/L和10 mg/L)的decorin對關節(jié)滑膜B型細胞活力有明顯抑制作用，提示要使decorin發(fā)揮有效的抑制作用必須要達到一定的濃度。流式細胞術檢測各實驗組和對照組，均未檢測到凋亡的細胞，表明decorin對細胞無明顯毒性。同時流式細胞術的結果表明高濃度的( 5 mg/L和10 mg/L) decorin能明顯增加G0/G1期細胞的數量，降低細胞的增殖率［( G2/M + S) %］，而低濃度組作用不明顯，表明decorin對關節(jié)滑膜B型細胞增殖抑制作用主要是使細胞停滯在靜止期，減少合成期和分裂期細胞的數量，而且這種作用有劑量效應，隨著decorin濃度增大，抑制作用越明顯，但具體能發(fā)揮最好抑制作用的最佳濃度有待深入研究。

如果使創(chuàng)傷愈合纖維瘢痕形成過程中I型膠原纖維合成的絕對量減少，即可有效抑制增生性瘢痕形成［8］，而decorin可與多種膠原分子(主要是I、Ⅱ、Ⅲ型)結合，阻止膠原分子在局部聚集［9］。其中decorin與I型膠原關系最為密切，而且decorin至少具有2個I型膠原結合的位點，Rajiv等［10］研究表明decorin可有效地下調I、Ⅲ型前膠原的mRNA的表達。本研究通過RT-PCR法檢測I型前膠原蛋白( PcI) mRNA的表達，結果顯示高濃度( 5 mg/L和10 mg/L)的decorin能明顯抑制關節(jié)滑膜B型細胞中Pc I mRNA的表達。通過Western blot法檢測I型膠原蛋白的表達，結果顯示每個時點隨著decorin濃度增高，關節(jié)滑膜B型細胞合成I型膠原蛋白的量減少，而且高濃度的decorin抑制作用更明顯。由此可見，decorin抑制僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞Ⅰ型膠原蛋白的合成主要是通過下調Pc I mRNA的表達，在轉錄水平上抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成，抑制膝關節(jié)滑膜囊纖維瘢痕的形成。

綜上所述，本實驗提示了應用decorin能夠抑制人僵直膝關節(jié)滑膜B型細胞的活力，同時下調Ⅰ型前膠原mRNA的表達，減少Ⅰ型膠原蛋白的合成，為防治創(chuàng)傷性膝關節(jié)愈合過程中膝關節(jié)囊纖維瘢痕的形成，以及創(chuàng)傷性膝關節(jié)僵直的臨床治療提供了一個新的思路。

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Effect of decorin on proliferation and collagen type I synthesis of stiff knee joint synovial type B cells

XING Bang-rong1，CHEN Yu-xian2，ZENG Hua1，YANG Xiao-yan1，LIANG Cai-qian1，ZHOU Wei-xiong1，KONG Qing-lei1，HAN Jian-hua1，ZHANG Yong-biao1
(1Department of Emergency，2Department of Orthopaedics，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China.E-mail: zhangyongbiaoo@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of decorin on procollagen type I ( PcI)，mRNA expression，collagen type I synthesis and proliferation of synovial type B cells of stiff knee joint synovial membrane.METHODS: Type B cells of synovial membrane were isolated from the stiff knee joint synovial membrane and cultured in vitro.The cells were treated with decorin at concentrations of 0.1 mg/L，5 mg/L and 10 mg/L.After cultured for 24 h，48 h and 72 h，the cell proliferation rates were measured by MTT colorimetric determination.Cell cycle distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry.The mRNA level of Pc I was detected by RT-PCR，while collagen type I was measured by Western blot.RESULTS: The proliferation of synovial type B cells was significantly inhibited，the percentage of synovial type B cells at G1phase was significantly increased by 5 mg/L and 10 mg/L decorin ( P＜0.05)，and PcⅠmRNA expression and collagen type I synthesis were significantly decreased.The cells with late apoptosis were not found in control group and experimental groups.CONCLUSION: Recombinant human decorin inhibits synovial type B cell proliferation and decreases PcⅠmRNA expression and collagen type I synthesis in synovial type B cells of stiff knee joint synovial membrane in vitro，suggesting that decorin potentially contributes to the therapy of human knee stiffness.

［KEY WORDS］Knee stiffness; synovial type B cells; Decorin; Collagen typeⅠ

通訊作者△Tel: 020-85252018; E-mail: zhangyongbiaoo@163.com

*［基金項目］廣東省自然科學基金資助項目( No.S2013010015461)

［收稿日期］2015-04-16［修回日期］2015-05-27

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1277-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.022