李龍光，李書(shū)華，王紅艷，龍　捷，謝曉斌，張雅潔(廣州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東廣州510182)

CXCR4啟動(dòng)子的條件復(fù)制型腺病毒對(duì)肺癌細(xì)胞的靶向殺傷作用*

李龍光，李書(shū)華，王紅艷，龍捷，謝曉斌，張雅潔△
(廣州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東廣州510182)

［摘要］目的:構(gòu)建CXCR4啟動(dòng)子的條件復(fù)制型腺病毒載體CRAd-CXCR4-GFP，探究CRAd-CXCR4-GFP對(duì)肺癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)。方法: PCR法擴(kuò)增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭質(zhì)粒pDC316-GFP，將骨架質(zhì)粒pBHG-lox-E1，3Cre和重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行PCR鑒定和腺病毒滴度測(cè)定; real-time PCR檢測(cè)5種肺癌細(xì)胞株CXCR4的mRNA表達(dá)，篩選出表達(dá)最高的A549細(xì)胞;將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，檢測(cè)兩者轉(zhuǎn)染后CXCR4啟動(dòng)子活性和腺病毒復(fù)制數(shù);將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和16HBE細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性。結(jié)果:成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP，與骨架質(zhì)粒pBHG-lox-E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后第11天可見(jiàn)片狀綠色熒光; PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重組腺病毒基因組中;測(cè)定重組腺病毒滴度為1×10(13)PFU/L; CRAd-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后E1A的mRNA和E4表達(dá)較Ad-NULL組明顯上升;與Ad-NULL組和空白對(duì)照組相比，CRAd-CXCR4-GFP組前4 d A549細(xì)胞凋亡率和活性無(wú)明顯差異，第5天細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞活性明顯降低，各組間5 d內(nèi)16HBE細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活性均無(wú)明顯變化。結(jié)論:成功構(gòu)建條件復(fù)制型腺病毒表達(dá)載體CRAd-CXCR4-GFP，該載體對(duì)肺癌細(xì)胞具有靶向殺傷作用。

［關(guān)鍵詞］條件復(fù)制型腺病毒;腫瘤特異性啟動(dòng)子; CXCR4啟動(dòng)子

條件復(fù)制型腺病毒是一組經(jīng)過(guò)基因改造的腺病毒，它能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞中完成感染和復(fù)制周期，從而特異性溶解腫瘤細(xì)胞，卻不傷及正常細(xì)胞。利用腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因E1A是構(gòu)建條件復(fù)制型腺病毒的常用方法，而條件復(fù)制型腺病毒在臨床應(yīng)用中仍出現(xiàn)啟動(dòng)子廣譜性差的問(wèn)題［1］。

CXCR4是趨化因子SDF-1的特異性受體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCR4在多種組織中表達(dá)而在正常組織幾乎不表達(dá)，與常用的腫瘤特異性啟動(dòng)子survivin、hTERT和COX-2相比，CXCR4啟動(dòng)子在肝臟的活性很低［2］。因此，為進(jìn)一步增強(qiáng)治療基因的靶向性，我們利用CXCR4啟動(dòng)子能特異性使腺病毒在肺癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并溶解肺癌細(xì)胞的特性，用CXCR4啟動(dòng)子替換控制腺病毒復(fù)制必需基因E1A的啟動(dòng)子，構(gòu)建新的條件復(fù)制型腺病毒表達(dá)載體CRAd-CXCR4-GFP，并探究該載體對(duì)肺癌細(xì)胞的靶向殺傷效應(yīng)。

材料和方法

1材料

293細(xì)胞株、A549細(xì)胞株、H460細(xì)胞株、H520細(xì)胞株、H1299細(xì)胞株、PAA細(xì)胞株、16HBE細(xì)胞株及腺病毒載體Ad-NULL均由廣州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室保存;感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pMD19-CXCR4-E1A、腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG-lox-E1，3Cre及穿梭質(zhì)粒pDC316-GFP及腺病毒純化試劑盒均購(gòu)自深圳百恩維生物科技有限公司; T4連接酶、限制性內(nèi)切酶MluⅠ和HindⅢ、PrimeScript RT Reagent Kit、CCK-8試劑盒均購(gòu)自TaKaRa; Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、質(zhì)粒大量抽提試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)自QIAGEN。引物合成及DNA測(cè)序由Invitrogen完成。

2方法

2.1重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP的構(gòu)建和鑒定

以質(zhì)粒pMD19-CXCR4-E1A為模板，PCR擴(kuò)增人CXCR4-E1A序列，在引物中加入MluⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。利用Primer 5. 0進(jìn)行引物設(shè)計(jì): CXCR4-E1A上游引物為5’-CGGACGCGTGAAATGCCTCTGGGAGGTCCTGTCC-3’，下游引物為5’-CCCAAGCTT-

TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTC-3’，產(chǎn)物大小為1 301 bp。反應(yīng)條件為95℃3 min; 95℃20 s，55℃30 s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，與穿梭質(zhì)粒pDC316-GFP分別進(jìn)行MluⅠ+ HindⅢ雙酶切。酶切片段回收、連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的重組克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確的克隆進(jìn)行大規(guī)模質(zhì)粒提取，用于腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)。

2.2條件復(fù)制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP的包裝與擴(kuò)增重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP、骨架質(zhì)粒pBHG-lox-E1，3Cre和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝，同時(shí)以質(zhì)粒pDC316-GFP為陰性對(duì)照。每天觀察熒光表達(dá)和出毒跡象，出毒跡象為細(xì)胞收縮變圓，并伴隨有細(xì)胞脫落，待細(xì)胞大部分病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落后，進(jìn)行收毒，為條件復(fù)制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP母液，標(biāo)記為P1。擴(kuò)增培養(yǎng)293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，加入CRAd-CXCR4-GFP母液P1，感染60 h后收集細(xì)胞。－80℃/37℃反復(fù)凍融3次，10 000×g離心10 min收集腺病毒上清。腺病毒擴(kuò)增至第3代( passage 3，P3)時(shí)，用腺病毒純化試劑盒純化P3病毒。

2.3CRAd-CXCR4-GFP的鑒定與滴度測(cè)定收集P3代病毒，沸水孵育10 min后立即冰浴。短暫離心后取上清用于PCR鑒定模板。特異性引物、擴(kuò)增體系和條件同材料和方法2，同時(shí)用pDC316-CXCR4-GFP作為陽(yáng)性對(duì)照。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。在腺病毒滴度測(cè)定前1 d取48孔板，每孔加入3×104個(gè)293細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基10倍梯度稀釋腺病毒，經(jīng)48 h感染，利用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞情況。在最高稀梯度m的孔數(shù)出n( n＜10)個(gè)帶熒光的細(xì)胞，則腺病毒滴度為n×10m +3/L( m為稀釋梯度)，若n＞10，則需繼續(xù)稀釋。

2.4Real-time PCR檢測(cè)5種肺癌細(xì)胞株CXCR4 mRNA表達(dá)用Trizol法提取A549細(xì)胞、H460細(xì)胞、H520細(xì)胞、H1299細(xì)胞、PAA細(xì)胞和16HBE細(xì)胞總RNA，按照RT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用Primer 5. 0進(jìn)行熒光定量引物設(shè)計(jì)，CXCR4上游引物為5’-CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG-3’，下游引物為5’-ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG-3’，產(chǎn)物99 bp; GAPDH為5’-AAATCTGGCACCACACCT-3’，下游引物為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，產(chǎn)物145 bp。使用7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，按照real-time PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量分析，CXCR4的擴(kuò)增條件為95℃3 min; 95℃45 s，57℃60 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán);最后72℃5 min; GAPDH的擴(kuò)增條件同CXCR4。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以表達(dá)倍數(shù)=2－ΔΔCt表示基因的表達(dá)量，計(jì)算表達(dá)倍數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5CXCR4啟動(dòng)子在A549細(xì)胞內(nèi)活性的檢測(cè)將1. 5×106個(gè)A549細(xì)胞鋪于6孔板，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實(shí)驗(yàn)組)和Ad-NULL(空載體組)，同時(shí)加入500 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后提取各組細(xì)胞RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用Primer 5. 0進(jìn)行熒光定量引物設(shè)計(jì)，E1A上游引物為5’-CCTCCTAGCCATTTTGAACCAC-3’，下游引物為5’-GCACCGCCAACATTACAGAG-3’，產(chǎn)物124 bp。使用7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，按照realtime PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量分析，E1A與GAPDH的擴(kuò)增條件及定量分析同上，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.6重組載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后腺病毒復(fù)制數(shù)的檢測(cè)將1. 5×106個(gè)A549細(xì)胞鋪于6孔板，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實(shí)驗(yàn)組)和Ad-NULL(空載體組)，同時(shí)加入500 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;轉(zhuǎn)染48 h后提取各組細(xì)胞DNA。利用Primer 5. 0進(jìn)行熒光定量引物設(shè)計(jì)，E4上游引物為5’-CAAGCGCAGGTAGATTAAAGTGG-3’，下游引物為5’-GGTTTAGGATGGTGGTGGATG-3’，產(chǎn)物127 bp。使用7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量分析，E4與GAPDH的擴(kuò)增條件及定量分析同上。

2.7重組載體體外功能檢測(cè)將1. 5×106個(gè)A549 和16HBE細(xì)胞鋪于6孔板，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實(shí)驗(yàn)組) 和Ad-NULL(空載體組)，并設(shè)空白對(duì)照組。同時(shí)加入500 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;分別在轉(zhuǎn)染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，使用胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞;加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，置流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將1×104個(gè)A549和16HBE細(xì)胞鋪于96孔板，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%時(shí)，分別加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(實(shí)驗(yàn)組)和Ad-NULL(空載體組)，并設(shè)空白對(duì)照組。同時(shí)加入500 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;分別在轉(zhuǎn)染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，加入10 μL CCK-8溶液，然后置于培養(yǎng)箱孵育1 h;將96孔板置于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度( A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所用數(shù)據(jù)采用SPSS 16. 0軟件進(jìn)行處理，所得數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP的構(gòu)建和鑒定

PCR擴(kuò)增CXCR4-E1A序列，產(chǎn)物純化后與載體pDC316-GFP進(jìn)行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，得到數(shù)十個(gè)克隆。挑取4個(gè)克隆，小量搖菌后進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其中1、2和4出現(xiàn)約1 301 bp和5 885 bp兩條帶，可能為陽(yáng)性克隆(圖1)。經(jīng)測(cè)序鑒定與GenBank提供的序列一致，重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP構(gòu)建成功。

Figure 1.The identification of pDC316-CXCR4-GFP by enzymedigestion.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1～4: pDC316-CXCR4-GFP digested by MluⅠand HindⅢ.圖1　pDC316-CXCR4-GFP的酶切鑒定結(jié)果

2 CRAd-CXCR4-GFP的包裝

重組質(zhì)粒pDC316-CXCR4-GFP和骨架質(zhì)粒pBHG-lox-E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并以pDC316-GFP作為陰性對(duì)照。24 h后熒光顯微鏡下觀察293細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。因?yàn)閜DC316-CXCR4-GFP分子量比pDC316-GFP大，所以轉(zhuǎn)染效率較后者低，熒光表達(dá)較弱。隨著轉(zhuǎn)染細(xì)胞的傳代，熒光細(xì)胞越來(lái)越少，但是pDC316-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后第11天，熒光細(xì)胞呈現(xiàn)片狀，說(shuō)明已包裝出P1腺病毒，而pDC316-GFP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后則無(wú)熒光擴(kuò)增現(xiàn)象，說(shuō)明沒(méi)有包裝出腺病毒，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The package of the first generation of adenovirus after 293 cells transfected with pDC316-CXCR4-GFP (×10).圖2　pDC316-CXCR4-GFP從轉(zhuǎn)染后到獲得P1腺病毒的綠色熒光圖

3 CRAd-CXCR4-GFP的鑒定與滴度測(cè)定

從CRAd-CXCR4-GFP的P3樣品中可以檢測(cè)到1 301 bp的條帶，表明目的基因已成功整合在重組腺病毒基因組中(圖3)。用本文所述方法測(cè)得CRAd-CXCR4-GFP滴度為1×1013PFU/L。

4 5種肺癌細(xì)胞株CXCR4的表達(dá)

結(jié)果顯示，在5種肺癌細(xì)胞株中，A549細(xì)胞CXCR4表達(dá)最高，見(jiàn)圖4。

5 CXCR4啟動(dòng)子在A549細(xì)胞內(nèi)活性

各組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組的E1A mRNA表達(dá)較空載體組明顯增強(qiáng)( P＜0. 01)，見(jiàn)圖5。

6 CRAd-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后的腺病毒復(fù)制數(shù)

各組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，實(shí)驗(yàn)組的E4 mRNA表達(dá)較空載體組明顯增強(qiáng)( P＜0. 01)，見(jiàn)圖6。

Figure 3.The CRAd-CXCR4-GFP identified by PCR.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1: pDC316-CXCR4-GFP as the template; Lane 2: CRAd-CXCR4-GFP diluted 10 times as the template.圖3　CRAd-CXCR4-GFP P3代病毒的PCR鑒定結(jié)果

Figure 4.The expression of CXCR4 mRNA in 6 kinds of lung cancer cell lines detected by real-time PCR.Mean± SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs other cell lines.圖4　Real-time PCR檢測(cè)6種肺癌細(xì)胞株CXCR4的mRNA表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression of E1A detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.圖5　Real-time PCR檢測(cè)E1A的mRNA表達(dá)

7 CRAd-CXCR4-GFP的體外功能

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，各組轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，與空載體組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組前4 d細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異，第5天凋亡率明顯增加( P＜0. 01)，CCK-8實(shí)驗(yàn)亦顯示，與空載體組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組前4 d細(xì)胞活性率無(wú)明顯差異，第5天活性率明顯降低( P＜0. 01)，見(jiàn)圖7、8。各組間5天內(nèi)16HBE細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞活性率均無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖9、10。

Figure 6.The mRNA expression of E4 detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.圖6　Real-time PCR檢測(cè)E4 mRNA的表達(dá)

Figure 7.The apoptotic rate of A549 cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.圖7　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間A549細(xì)胞的凋亡情況

Figure 8.The viability of A549 cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.圖8　CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間A549細(xì)胞活性的變化

討論

惡性腫瘤的基因治療是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。腺病毒載體以其轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)染細(xì)胞類(lèi)型廣泛，不整合到宿主染色體等特點(diǎn)而成為常用的基因載體。目前主要有3種腺病毒系統(tǒng)，包括AdEasy系統(tǒng)、AdMax系統(tǒng)和Adeno-X系統(tǒng)。AdMax包裝系統(tǒng)的重組過(guò)程發(fā)生在293細(xì)胞，與其它2種系統(tǒng)相比，避免了在細(xì)菌中重組，因此該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、重組效率較高和目的基因的表達(dá)水平高(系統(tǒng)中的mCMV啟動(dòng)子比CMV啟動(dòng)子強(qiáng)若干倍)［3-4］。我們利用AdMax包裝系統(tǒng)成功構(gòu)建了條件復(fù)制型腺病毒載體CRAd-CXCR4-GFP，酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明了CXCR4-E1A基因成功整合進(jìn)重組腺病毒基因組，重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染293細(xì)胞11 d后包裝出P1腺病毒并進(jìn)行病毒的擴(kuò)增，測(cè)定病毒滴度為1×1013PFU/L，可用于后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)。

Figure 9.The apoptotic rate of 16HBE cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n =3.圖9　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間16HBE細(xì)胞的凋亡情況

Figure 10.The viability of 16HBE cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n =3.圖10　CCK-8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間16HBE細(xì)胞活性的變化

條件復(fù)制型腺病毒的生活周期包括:轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞→外源基因表達(dá)→復(fù)制→溶瘤→子代腺病毒釋放→重復(fù)感染，每個(gè)階段的效率都與其抗癌效應(yīng)密切相關(guān)［5］。CXCR4啟動(dòng)子是腺病毒的復(fù)制開(kāi)關(guān)，因此細(xì)胞內(nèi)CXCR4的表達(dá)決定了腺病毒的復(fù)制能力以及由腺病毒導(dǎo)致的靶向溶瘤作用。本研究中，我們首先利real-time PCR方法從5種肺癌細(xì)胞株篩選出CXCR4高表達(dá)的A549細(xì)胞株，作為靶細(xì)胞用于后續(xù)研究。

Zhu等［2］構(gòu)建的CRAd-CXCR4. RGD已在體內(nèi)外證明了該載體對(duì)肺癌較強(qiáng)的靶向性和較低的肝毒性，那我們構(gòu)建的CRAd-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，CXCR4是否可以啟動(dòng)腺病毒的復(fù)制呢?我們將CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，采用real-time PCR方法檢測(cè)E1A mRNA的表達(dá)情況，可見(jiàn)A549細(xì)胞中E1A mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明CXCR4啟動(dòng)子在A549細(xì)胞內(nèi)具有較高的啟動(dòng)活性。Kim等［6］已證明少量的E1A表達(dá)就能滿足腺病毒的復(fù)制。

腺病毒的復(fù)制數(shù)決定了條件復(fù)制型腺病毒的溶瘤能力，E1A的表達(dá)只能反映腺病毒在靶細(xì)胞內(nèi)有無(wú)復(fù)制，并不能體現(xiàn)腺病毒具體的復(fù)制拷貝數(shù)。目前多采用檢測(cè)E4的表達(dá)來(lái)反映腺病毒具體的復(fù)制能力［7］。本研究采用熒光定量PCR檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549細(xì)胞的E4表達(dá)水平，可見(jiàn)在A549細(xì)胞中E4呈高表達(dá)，表明CRAd-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后病毒具有強(qiáng)大的復(fù)制能力。

強(qiáng)大的復(fù)制能力保證了溶瘤腺病毒功能的實(shí)現(xiàn)。我們利用流式細(xì)胞儀對(duì)分別轉(zhuǎn)染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549細(xì)胞和16HBE細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，與空載體組和空白對(duì)照組相比，CRAd-CXCR4-GFP組前4 d細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異，第5天凋亡率明顯增加，CCK-8實(shí)驗(yàn)亦顯示，實(shí)驗(yàn)組前4 d細(xì)胞活性率無(wú)明顯差異，第5天活性率明顯降低。結(jié)果表明CRAd-CXCR4-GFP轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后腺病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，第5天時(shí)復(fù)制的腺病毒引起了細(xì)胞的大量壞死。那本研究構(gòu)建的溶瘤病毒是否具有腫瘤細(xì)胞靶向性?我們采用流式細(xì)胞儀與CCK-8-檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)分別轉(zhuǎn)染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL的永生化支氣管上皮細(xì)胞16HBE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示各組間5 d內(nèi)16HBE細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞活性率均無(wú)明顯變化，而相同條件轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞可見(jiàn)發(fā)生了細(xì)胞的大量死亡，說(shuō)明CXCR4啟動(dòng)子的條件復(fù)制型腺病毒能夠發(fā)揮靶向溶解肺癌細(xì)胞的作用。國(guó)內(nèi)外已有大量實(shí)驗(yàn)證明CXCR4啟動(dòng)子的腫瘤靶向性。Chu等［8］證明了構(gòu)建的Ad5/3-CXCR4-E1A能特異性溶解胰腺癌細(xì)胞，而對(duì)正常胰腺細(xì)胞無(wú)毒性; Rajendran等［9］指出CXCR4啟動(dòng)子的條件復(fù)制型腺病毒對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有靶向殺傷效應(yīng);在卵巢癌的研究中亦有相似的報(bào)道［10］，由此說(shuō)明了CXCR4啟動(dòng)子的廣譜性，其有望應(yīng)用于多數(shù)腫瘤的臨床治療。

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Conditionally replicating adenovirus activated by CXCR4 promoter in lung cancer

LI Long-guang，LI Shu-hua，WANG Hong-yan，LONG Jie，XIE Xiao-bin，ZHANG Ya-jie
( Department of Pathology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China.E-mail: yajie.zhang@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To construct a conditionally replicating adenovirus vector activated by CXCR4 promoter and to evaluate its ability of lysing the lung cancer cells specifically.METHODS: Human CXCR4-E1A gene amplified by PCR was cloned into the shuttle plasmid pDC316-GFP to construct the recombinant shuttle plasmid pDC316-CXCR4-GFP.The recombinat shuttle plasmid and adenovirus genomic plasmid pBHG-lox-E1，3Cre were transfected into 293 cells to construct the recombinant adenovirus CRAd-CXCR4-GFP.PCR was used to detect the target gene fragments，and the viral titer was determined.A549 cells with the highest mRNA expression of CXCR4 were screened out from 5 kinds of lung cancer cell lines by real-time PCR.CXCR4 promoter activity and adenovirus replication numbers were detected in A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL.CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL were transfected into A549 cells and 16HBE cells，the apoptotic rates were detected by flow cytometry and the viability was analyzed by CCK-8 assay.RESULTS: The recombinant plasmid pDC316-CXCR4-GFP was constructed successfully.Green fluorescence was observed in 293 cells under fluorescent microscope after co-transfection of pDC316-CXCR4-GFP and pBHG-lox-E1，3Cre at 11 d.Green fluorescence was observed in 293 cells after infection of amplified 3rd generational adenovirus.PCR showed that the purpose gene was successfully integrated in recombinant adenovirus genome.The virus in the supernatant reached a titer of 1×10(13)PFU/L.The mRNA expression of E1A and E4 in the A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP was markedly increased compared with Ad-NULL group.Compared with Ad-NULL group and empty control group，the apoptoticbook=1204,ebook=60rate and the viability of A549 cells in CRAd-CXCR4-GFP group had no significant difference in the first 4 d，the apoptotic rate increased significantly at 5 d，and the cell viability declined significantly at 5 d，but the apoptotic rate and the viability of 16HBE cells in each group had no significant difference within 5 days.CONCLUSION: The conditionally replicating adenovirus vector CRAd-CXCR4-GFP has been successfully constructed，which has the ability of lysing lung cancer cells specifically.

［KEY WORDS］Conditionally replicating adenovirus; Tumor-specific promoter; CXCR4 promoter

通訊作者△Tel: 020-81340347; E-mail: yajie.zhang@163.com

*［基金項(xiàng)目］教育部博士點(diǎn)基金博導(dǎo)類(lèi)課題( No.20134423110001) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.S2012010010181) ;廣州市科技計(jì)劃( No.2014Y2-00171) ;廣州市教育系統(tǒng)創(chuàng)新學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目( No.13C06)

［收稿日期］2014-06-16［修回日期］2015-04-20

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1203-06

［中圖分類(lèi)號(hào)］R392. 12

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.009