張彩鳳，董良鵬，夏永華，郭曉鶴，張利利，周慧聰，張?zhí)m芳，李貞娟，韓　宇(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，普通外科，皮膚科，河南衛(wèi)輝4500)

DEK表達(dá)下調(diào)通過抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中NF-κB信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡*

張彩鳳1△，董良鵬2，夏永華3，郭曉鶴1，張利利1，周慧聰1，張?zhí)m芳1，李貞娟1，韓宇1
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1消化內(nèi)科，2普通外科，3皮膚科，河南衛(wèi)輝453100)

［摘要］目的:研究DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，并分析其與NF-κB信號途徑及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法:將DEK siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，并將SGC-7901細(xì)胞分為未處理組、對照siRNA組及DEK siRNA組。采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測3組胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK mRNA和蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測3組SGC-7901細(xì)胞凋亡的變化; Caspase-Glo-3/9試劑盒檢測3組SGC-7901細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活性; Western blot技術(shù)檢測3組SGC-7901細(xì)胞中NF-κB信號途徑關(guān)鍵調(diào)控蛋白p65及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。結(jié)果:與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組SGC-7901細(xì)胞中DEK的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)( P＜0.05)。DEK siRNA組SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著高于未處理組和對照siRNA組( P＜0.05)。最為顯著的是，DEK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，p65和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，并伴隨caspase-3和caspase-9活性上升。結(jié)論: DEK表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞凋亡可能與NF-κB信號途徑密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］胃癌; DEK;細(xì)胞凋亡; NF-κB信號途徑

胃癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居第4位，其死亡率為惡性腫瘤死亡率的第2位［1-3］。盡管胃癌的手術(shù)及化療方案有很大的改善［4-5］，胃癌仍保持較高的致死率和較低的存活率［6］。目前，腫瘤分子靶向治療可能成為繼手術(shù)、放療和化療之后的新的替代手段，因此，尋找新的分子靶點治療胃癌具有十分重要的意義。

DEK基因定位于染色體6p，最初在急性髓系白血病染色體轉(zhuǎn)位t( 6; 9) ( p23; q34)中的靶點被發(fā)現(xiàn)［7］。隨著分子腫瘤學(xué)的快速發(fā)展，對于DEK功能的闡明也逐漸明晰，研究顯示，DEK作為染色質(zhì)構(gòu)建蛋白，在mRNA的剪接、轉(zhuǎn)錄控制、DNA損傷修復(fù)、分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及化療抗性中發(fā)揮極其重要的作用［8-11］。進(jìn)一步研究表明，DEK在多種不同的腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［12-16］。此外，DEK在胃癌組織中的表達(dá)水平也顯著高于胃黏膜異型增生組織和正常組織［17］，提示DEK可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用，但其分子機(jī)制尚需探討。本研究中，我們利用DEK特異性的siRNA下調(diào)胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK mRNA和蛋白的表達(dá)，研究DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，并分析其對NF-κB信號途徑關(guān)鍵調(diào)控蛋白p65的表達(dá)、凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的活性以及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，初步探討其介導(dǎo)凋亡可能的分子機(jī)制，該研究有望為以DEK為分子靶點的胃癌基因治療提供新的實驗證據(jù)。

材料和方法

1細(xì)胞株和實驗材料

胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自Gibco;脂質(zhì)體2000購自Invitrogen; TRIzol購自Invitrogen;一步法實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司;蛋白裂解液購自TaKaRa;凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC Kit購自BD; Caspase-Glo-3/9試劑盒購自Promega; DEK、p65、Bcl-2、Bax 和β-actin抗體以及DEK siRNA和對照siRNA( control siRNA)均購自Santa Cruz。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染將胃癌SGC-7901細(xì)胞株從液氮中取出，置于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中復(fù)蘇，傳3代后，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時，按照脂質(zhì)體2000的說明書將DEK siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞。在后續(xù)實驗中將細(xì)胞分為未處理組(培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞不進(jìn)行任何處理)，對照siRNA組(將對照siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞)和DEK siRNA組(將DEK siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組別的SGC-7901細(xì)胞凋亡將DEK siRNA轉(zhuǎn)染后于48 h收獲細(xì)胞，采用預(yù)冷PBS緩沖液漂洗，按1×109/L密度重懸細(xì)胞，接著取100 μL細(xì)胞置于流式管中，加入Annexin VFITC和PI各5 μL，于避光下孵育15 min后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測10 000個細(xì)胞，最后采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

2.3不同組別的SGC-7901細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活性分析按照Caspase-Glo-3/9試劑盒說明書檢測caspase-3和caspase-9的活性，其步驟如下: DEK siRNA和對照siRNA轉(zhuǎn)染后于48 h收獲細(xì)胞，并置于緩沖液( 25 mmol/L Hepes，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L Pefabloc和胃酶抑素、亮肽素和抑肽酶各1 mg/L)，充分懸浮后，于4℃13 000 r/min離心15 min。將澄清的提取液中的蛋白濃度預(yù)先調(diào)整為1 g/L，－80℃下凍存。為了測定caspase活性，將稀釋后的提取液( 10 mg/ L)與Caspase-Glo檢測試劑等體積混合，置于96孔白壁培養(yǎng)板中。室溫孵育1 h，然后使用讀板的發(fā)光檢測儀讀數(shù)。

2.4實時熒光定量PCR檢測不同組別的SGC-7901細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后48 h的3組胃癌SGC-7901細(xì)胞，采用TRIzol試劑分別提取各組不同處理的SGC-7901細(xì)胞的總RNA，設(shè)計DEK的上游引物為5’-CCAGGCACTGTGTCCTCATT-3’，下游引物為5’-GGCAATGGTTTGCCAGAAGG-3’，產(chǎn)物大小為233 bp;內(nèi)參照β-actin的上游引物為5’-GTCACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物為5’-TAGCAACGTACATGGCTGGG-3’，產(chǎn)物大小為181 bp。然后按一步法實時熒光定量PCR試劑盒的操作說明配制反應(yīng)體系，于ABI 7300儀器上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50℃30 min。PCR條件: 94℃2 min; 94℃30 s，56℃30 s，65℃延伸30s，35個循環(huán)。實驗中每個樣品重復(fù)3次，基因的相對表達(dá)分析采用2－ΔΔCt方法進(jìn)行計算［18］。

2.5Western blot檢測蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后48 h 的3組不同處理的胃癌SGC-7901細(xì)胞，提取總蛋白并行SDS-PAGE，接著取下凝膠并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。然后采用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉NC膜2 h，加入Ⅰ抗( DEK、p65、Bcl-2、Bax和β-actin，1∶200)，于4℃搖床中過夜孵育。次日加入Ⅱ抗于室溫孵育2 h。將NC膜置于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3 min，于暗室中采用X射線曝光，常規(guī)方法進(jìn)行顯影、定影，顯示特異的蛋白信號。蛋白表達(dá)的灰度值利用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，蛋白相對表達(dá)水平為目的基因的灰度值與內(nèi)參照基因的灰度值的比值，其中β-actin作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對上述實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，3組之間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 DEK siRNA顯著下調(diào)胃癌SGC7901細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)

將DEK siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后48 h，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中DEK mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中DEK mRNA的表達(dá)無差異，見圖1。

Figure 1.DEK siRNA inhibited the mRNA expression of DEK in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖1　DEK siRNA抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)

2 DEK siRNA顯著下調(diào)胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK蛋白的表達(dá)

將DEK siRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后48 h，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中DEK蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中DEK蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2。

3 DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中胃癌SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著上升( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組中SGC-7901細(xì)胞的凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖3。

Figure 2.DEK siRNA inhibited the protein expression of DEK in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖2　DEK siRNA抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK蛋白的表達(dá)

4 DEK表達(dá)下調(diào)抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞中p65的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討DEK表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后NF-κB信號途徑中的關(guān)鍵蛋白p65的表達(dá)。結(jié)果表明，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中SGC-7901細(xì)胞中p65蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)( P＜0. 05)，而未處理組和對照siRNA組之間p65蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖4，這些結(jié)果表明DEK表達(dá)下調(diào)能顯著抑制胃癌細(xì)胞中NF-κB信號途徑。

5 3組胃癌SGC-7901細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活性分析

Figure 4.The effect of DEK downregulation on NF-κB signaling pathway in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean± SD.n =3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖4　DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌SGC-7901細(xì)胞中NF-κB信號途徑的影響

6 DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步分析DEK表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能的分子機(jī)制，我們又采用Westernblot分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與未處理組和對照siRNA組相比，DEK siRNA組中SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)( P＜0.05)，而未處理組和對照siRNA組之間Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)無顯著差異，見圖5。

表1　3組胃癌SGC-7901細(xì)胞的caspase-3和caspase-9活性分析Table 1.The activities of caspase-3 and caspase-9 in the SGC-7901 cells with different treatments ( Mean±SD.n = 3)

討論

DEK作為高度保守的核基因，優(yōu)先表達(dá)在增殖活躍的細(xì)胞和惡性腫瘤中，其在每個核中大概有4～5百萬個拷貝［19］。DEK已經(jīng)被證實能促進(jìn)多種不同類型的腫瘤發(fā)生，這可能是由于其能抑制細(xì)胞的分化、衰老和凋亡［11］，因而抑制DEK的表達(dá)有望成為腫瘤治療的潛在分子靶點。為了分析DEK在胃癌中的功能，我們首先將DEK siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后DEK mRNA和蛋白的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)DEK siRNA轉(zhuǎn)染后的48 h，胃癌SGC-7901細(xì)胞中DEK mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于未處理組和對照siRNA組，提示DEK siRNA能顯著下調(diào)胃癌細(xì)胞中DEK mRNA和蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步闡明DEK的功能提供了極其理想的研究平臺。

Figure 5.The effect of DEK downregulation on the protein expression of Bcl-2 and Bax in gastric carcinoma SGC-7901 cells.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05 vs DEK siRNA group.圖5　DEK表達(dá)下調(diào)對胃癌SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

腫瘤細(xì)胞最為顯著的特征之一是逃避細(xì)胞凋亡［20］，因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能成為腫瘤治療的新的策略和手段。研究表明，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中敲除DEK能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能至少部分通過腫瘤抑制基因p53的誘導(dǎo)實現(xiàn)［21］。此外，DEK新的凋亡功能在轉(zhuǎn)錄控制的抗凋亡蛋白MCL-1中被鑒定［8］。Liu等［22］研究表明，沉默DEK的表達(dá)能誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞的凋亡和衰老，這可能主要通過抑制NF-κB信號途徑實現(xiàn)。最為重要的是，Kim等［23］利用質(zhì)譜分析DEK的作用靶點時，發(fā)現(xiàn)DEK能調(diào)控58個下游靶蛋白，其中包括41個上調(diào)基因和17個下調(diào)基因，最后對58個蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)16%的蛋白與凋亡相關(guān)。這些研究表明DEK可能在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮極其關(guān)鍵的作用，在本研究中，為了闡明是否DEK表達(dá)下調(diào)能引起胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，我們采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理的胃癌細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEK siRNA組中胃癌SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均顯著高于未處理組和對照siRNA組，提示DEK表達(dá)下調(diào)能明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究表明，調(diào)控NF-κB信號途徑可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的凋亡［24］，因而可能成為潛在的分子治療靶點［25］。激活的NF-κB信號途徑在胃癌SGC-7901細(xì)胞中主要表現(xiàn)為抗凋亡作用，其分子機(jī)制是通過直接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，如通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白來發(fā)揮抗凋亡作用［26］。此外，caspases的活化是細(xì)胞程序性死亡的終末期，該過程能被Bcl-2家族成員所抑制［27］，可以通過激活caspases的活性切割作用而誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象［28］。研究顯示，抑制DEK的表達(dá)能通過抑制NF-κB信號途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］。為了進(jìn)一步分析DEK表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，我們采用Western blot技術(shù)檢測不同處理的胃癌SGC-7901細(xì)胞中NF-κB信號途徑的關(guān)鍵組分p65蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax的表達(dá)，并分析caspase-3和caspase-9的活性，我們發(fā)現(xiàn)，DEK表達(dá)下調(diào)能顯著降低胃癌細(xì)胞中p65蛋白的表達(dá)，提示DEK表達(dá)下調(diào)能抑制胃癌細(xì)胞中NF-κB信號途徑。進(jìn)一步的研究顯示，DEK表達(dá)下調(diào)能顯著增加caspase-3和caspase-9的活性，提高Bax的表達(dá)和降低Bcl-2的表達(dá)。這些結(jié)果提示DEK表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡與NF-κB信號途徑的抑制或失活密切相關(guān)，并與凋亡相關(guān)蛋白的活性或表達(dá)變化密切相關(guān)。

總之，我們的結(jié)果顯示，DEK siRNA能顯著下調(diào)胃癌細(xì)胞中DEK mRNA和蛋白的表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，這與NF-κB信號途徑的抑制密切相關(guān)，并使得caspase-3和caspase-9的活性以及Bax的表達(dá)升高和Bcl-2的表達(dá)降低，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，DEK可能成為新的胃癌治療的分子靶點。

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Downregulation of DEK induces cell apoptosis via inhibition of NF-κB signaling pathway in gastric carcinoma SGC-7901 cells

ZHANG Cai-feng1，DONG Liang-peng2，XIA Yong-hua3，GUO Xiao-he1，ZHANG Li-li1，ZHOU Hui-cong1，ZHANG Lan-fang1，LI Zhen-juan1，HAN Yu1
(1Department of Gastroenterology，2Department of General Surgery，3Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Weihui 453100，China.E-mail: zhangcaifeng666@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of DEK downregulation on the apoptosis of gastric carcinoma SGC-7901 cells，and to explore its associations with NF-κB signaling pathway and apoptosis related proteins.METHODS: SGC-7901 cells with different treatments were divided into 3 groups including untreated group，control siRNA group and DEK siRNA group.The expression of DEK at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells was detected by real-time PCR and Western blot.The cell apoptosis was examined by flow cytometry.Furthermore，the activities of caspase-3 and caspase-9 in the SGC-7901 cells were investigated by Caspase-Glo-3/9 kit.Finally，the expression of key regulatory protein p65 of NF-κB signaling pathway and apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in the SGC-7901 cells was investigated by Western blot.RESULTS: Compared with untreated group and control siRNA group，the expression of DEK at mRNA and protein levels was significantly downregulated in DEK siRNA group ( P＜0.05).In addition，the ratios of early phase apoptosis and total apoptosis in DEK siRNA group were markedly higher than those in untreated group and control siRNA group ( P＜0.05).Most notably，the decrease in p65 and Bcl-2 proteins，increase in Bax protein and the increases of caspase-3 and caspase-9 activities were observed in DEK siRNA group.CONCLUSION: Downregulation of DEK mediates cell apoptosis of gastric carcinoma may be tightly associated with NF-κB signaling pathway.

［KEY WORDS］Gastric carcinoma; DEK; Apoptosis; NF-κB signaling pathway

通訊作者△Tel: 0373-4402216; E-mail: zhangcaifeng666@163.com

*［基金項目］河南省教育廳科技攻關(guān)項目( No.2009B320008) ;河南省衛(wèi)生廳科技攻關(guān)項目( No.200804055) ;新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金( No.2013QN128)

［收稿日期］2014-12-29［修回日期］2015-05-19

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1197-06

［中圖分類號］R730. 23; R735. 2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.008