顧祥仕

食管癌是臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，居惡性腫瘤發(fā)病率前3位，病情發(fā)展迅速，且預(yù)后較差，對患者生命安全造成極大威脅。我國是食管癌高發(fā)國家，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，我國每年死于食管癌的患者高達(dá)15萬[1]。食管癌的發(fā)生與微量元素、維生素的缺乏、化學(xué)刺激，經(jīng)常食用溫度較高的食物、吸煙、喝酒等不良生活習(xí)慣有關(guān)。從分子水平上來說，食管癌的發(fā)生、發(fā)展與其他癌癥相同，均與原癌基因被激活，抗凋亡基因被抑制有關(guān)。P21和P53是機(jī)體重要的兩個原癌基因，而HSP70對細(xì)胞的凋亡具有抑制的作用。本次研究對三者與食管癌發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行分析，取得較好結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2011年1月至2014年1月間的80例食管石蠟標(biāo)本為研究對象，所有患者均符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。其中60例為食管癌患者的石蠟標(biāo)本 （食管癌組），60例為正常食管的石蠟標(biāo)本（對照組）。食管癌組中48例男性，12例女性，年齡45～79歲，平均年齡（65.8±9.6）歲；分化程度：32例高分化癌，18例中分化癌，10例低分化癌；食管癌病理分型：21例慢性鱗狀上皮典型性增生，17例慢性鱗狀上皮非典型性增生，13例鱗狀上皮乳頭狀增生，9例腺體增生活躍。對照組中32例男性，28例女性，年齡43～78歲，平均年齡（64.9±9.1）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

二、方法

1.切片制作

組織蠟塊用切片機(jī)進(jìn)行切片處理，取3片進(jìn)行烤片。蠟去除后，將切片放于室溫下30 mL/L的雙氧水中密閉封存10 min。微波修復(fù)抗原10 min，然后冷卻至室溫，用PBS緩沖液連續(xù)沖洗2 min，室溫條件下加入山羊血清工作液密閉封存，孵育15 min，倒掉工作液，在每個切片上加入P21、P53、HSP70單克隆抗體，在4.0℃環(huán)境中過夜。次日清晨取出切片，放于37.0℃的恒溫箱中孵育1 h，加入50 μL的素-生物素和鏈親雙氧水，室溫條件下孵育40 min，PBS緩沖液洗滌3次，每次洗滌5 min[3-4]。然后加入二氨基聯(lián)苯胺雙氧水溶液進(jìn)行顯色5 min，蘇木精襯染處理，脫水透明后使用DPX密封固定。

2.切片篩選

由我院3位病理專家采用雙盲分析法對所有病理切片進(jìn)行分析、選擇，每張切片選擇10個高倍、典型的視野，保證計數(shù)細(xì)胞高于1 000個[5]，使用北京航空航天大學(xué)真彩色圖像分析系統(tǒng)體視力學(xué)分析軟件計算陽性細(xì)胞數(shù)量。

三、細(xì)胞著色評價標(biāo)準(zhǔn)

著色細(xì)胞數(shù)：0分=著色細(xì)胞數(shù)＜10%，1分=10%≤著色細(xì)胞數(shù)≤25%，2分=26%≤著色細(xì)胞數(shù)≤50%，3分=51%≤著色細(xì)胞數(shù)≤75%，4分=著色細(xì)胞數(shù)≥76%；著色程度：0分=無色，1分=淺黃色，2分=橘黃色，3分=棕褐色。統(tǒng)計著色細(xì)胞數(shù)與著色程度的總分，評價P21、P53、HSP70的表達(dá)情況。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

本次研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)錄入EXCEL（03版）行邏輯校對，數(shù)值變量采用標(biāo)準(zhǔn)差、均數(shù)表示。計量資料行t檢驗，等級分類資料行Ridit檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組P21、P53、HSP70的表達(dá)情況比較

食管癌組P21、P53的表達(dá)量明顯高于對照組，而HSP70的表達(dá)明顯低于對照組，見表1。

表1 兩組P21、P53、HSP70的表達(dá)情況比較 （±s）

表1 兩組P21、P53、HSP70的表達(dá)情況比較 （±s）

注：*與對照組相比，P＜0.05。

組別 n P21 P53 HSP70食管癌組 60 4.67±1.33* 4.95±0.54* 1.91±0.62*對照組 60 1.64±0.71 0.97±0.51 4.23±0.99 t值 - 15.56 41.50 15.38 P值 - 0.0000 0.0000 0.0000

二、不同分化程度食管癌中P21、P53、HSP70表達(dá)情況的比較

P21、P53的表達(dá)水平，高分化癌＞中分化癌＞低分化癌；而HSP70的表達(dá)則為高分化癌＜中分化癌＜低分化癌。見表2。

表2 不同分化程度食管癌中P21、P53、HSP70的表達(dá)情況比較 （±s）

表2 不同分化程度食管癌中P21、P53、HSP70的表達(dá)情況比較 （±s）

注：*與其他兩組相比，P＜0.05。

食管癌分化程度 n P21 P53 HSP70高分化癌 32 5.69±0.86* 5.96±0.54* 1.04±0.20*中分化癌低分化癌18 10 4.22±0.75 2.31±0.54 4.07±0.68 3.40±0.53 1.97±0.46 4.31±0.92 F值 - 75.17 103.55 187.09 P值 - 0.0000 0.0000 0.0000

三、免疫組化染色結(jié)果，見圖1。

圖1 食管癌免疫組化染色結(jié)果 （A可見HSP70微弱表達(dá)；B 4 h免疫組化染色，顯示食管癌細(xì)胞胞漿內(nèi)HSP70表達(dá)較高；C可見食管癌細(xì)胞胞漿內(nèi)P21表達(dá)較高；D可見食管癌細(xì)胞胞漿內(nèi)P53基因表達(dá)與局部體液免疫的關(guān)系）

討 論

食管癌發(fā)病率高，起病隱匿，難以在早期被發(fā)現(xiàn)，就診時常處于中晚期，嚴(yán)重影響預(yù)后。食管癌患者預(yù)后與年齡、腫瘤分化程度、臨床分期、腫瘤類型等多種因素有關(guān)[6]。細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA分子發(fā)生增殖，分裂的質(zhì)與量異常改變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病的物質(zhì)基礎(chǔ)，而機(jī)體抑癌基因被抑制或者發(fā)生缺失，以及原癌基因被激活是DNA分子增殖，是異常分裂的基礎(chǔ)[7]。由于對癌基因的深入研究，對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制也有了進(jìn)一步的了解，為惡性腫瘤的診治提供了新的方法。P21和P53是機(jī)體重要的兩個原癌基因，而HSP70對細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，P21蛋白屬于一種高度保守性蛋白，存在于細(xì)胞膜表面，該類蛋白與鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白具有類似的作用[8-9]。當(dāng)位于細(xì)胞膜表面的P21蛋白接受到信號后，與鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生結(jié)合，形成P21-鳥苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，并具有GTP酶活性，起到傳遞細(xì)胞內(nèi)信號的作用，從而對細(xì)胞的正常生長與增值發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如果P21蛋白表達(dá)量過高，可長時間刺激細(xì)胞生長，使細(xì)胞增值失去控制，從而形成腫瘤。研究表明，食管癌、肺癌、胃腸道癌等癌癥患者機(jī)體中均存在P21蛋白表達(dá)量過高的現(xiàn)象[10]。此次研究結(jié)果顯示，食管癌組P21蛋白表達(dá)量明顯高于正常食管，且高分化癌＞中分化癌＞低分化癌，由此可見P21蛋白與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且控制著食管癌的癌變過程與惡性維持。

P53基因?qū)儆谝职┗?，對調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及DNA修復(fù)有著重要作用。腫瘤組織中的P53基因突變時，野生型P53的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控作用喪失，獲得誘導(dǎo)原癌基因異常表達(dá)，抑制野生型P53轉(zhuǎn)錄活性等新功能，誘導(dǎo)、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11]。P53基因突變發(fā)生于大多數(shù)惡性腫瘤患者中，也有研究表明P53基因突變的癌癥患者存活率低于P53基因未突變患者。通過此次研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組P53基因的表達(dá)量明顯高于正常食管，且高分化癌＞中分化癌＞低分化癌，再一次證明突變型P53基因影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

HSP70屬于熱休克蛋白，幾乎所有生物應(yīng)激細(xì)胞中均存在HSP70高度誘導(dǎo)現(xiàn)象，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體與細(xì)胞的作用。腫瘤形成過程中，HSP70蛋白以一種分子伴侶的形式參與到細(xì)胞多肽合成的過程中，與多肽的折疊、組裝、運輸有密切關(guān)系。盛曉玲[12]在其研究報道中提出食管鱗狀細(xì)胞癌中的HSP70蛋白表達(dá)量較高，但食管鱗狀細(xì)胞癌分化程度越高，HSP70蛋白表達(dá)量越低。本次研究中食管癌組HSP70蛋白的表達(dá)量明顯低于正常食管，且高分化癌＜中分化癌＜低分化癌，與盛曉玲的報道一致。

綜上所述，癌癥的發(fā)生與多種因素有關(guān)，而細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡遭受抑制是引發(fā)癌癥的基礎(chǔ)條件。P21和P53是機(jī)體重要的原癌基因，而HSP70對細(xì)胞的凋亡具有抑制的作用，三者表達(dá)水平的變化與癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系，食管癌中P21和P53表達(dá)量上升，HSP70表達(dá)量下降，有助于提高食管癌的診斷，評價預(yù)后，值得臨床應(yīng)用。

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