陳麗萍，蔡劍雄，王 劍

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；2.上海師范大學 工程食品研究所，上海 徐匯 200234)

?

大鯢黏液低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性研究

陳麗萍1，蔡劍雄2*，王 劍1

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；2.上海師范大學 工程食品研究所，上海 徐匯 200234)

目的：充分利用大鯢資源，研究大鯢黏液低聚糖肽的抗血小板聚集、體外抑菌等生物活性。方法：采用全血電阻法血小板聚集試驗、體外抑菌實驗對大鯢黏液低聚糖肽進行生物活性研究。結(jié)果：血小板聚集試驗：胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶三種酶酶解產(chǎn)物均對ADP誘導的血小板聚集有抑制作用，其聚集度分別為(4.73±2.20)、(6.80±0.98)、(6.13±0.76)，抑制率分別為48.98%、26.65%、33.87%。體外抑菌活性實驗：大鯢黏液不同酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌兩種菌的抑菌效價>1∶2.5，其抑菌作用均不顯著。結(jié)論：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶大鯢黏液酶解產(chǎn)物具有顯著抗血小板聚集作用，大鯢黏液及其酶解產(chǎn)物沒有顯著抑菌作用。

大鯢黏液；抑菌；抗血小板聚集；生物活性

中國大鯢(Andrias davidianus)是我國特有的兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科的珍稀動物，屬于國家二級保護動物和傳統(tǒng)名貴藥用動物[1]。國內(nèi)大鯢生產(chǎn)和研究開發(fā)多集中在皮膚、肉、骨骼等，而有關大鯢體表——尤其是大鯢皮膚分泌物黏液的研究報道相對較少，同時大鯢資源開發(fā)迄今尚未形成效益顯著可持續(xù)綠色發(fā)展的大鯢資源深加工技術產(chǎn)業(yè)鏈，從而阻礙了大鯢資源進一步的生產(chǎn)開發(fā)利用[2-4]。素有“活化石”之稱的大鯢在長期進化適應過程中，其體表形成了良好的防御機制和豐富的生物學特性，同時研究證實大鯢體表分泌物酶解低聚糖肽在心血管系統(tǒng)疾病、抗衰老、保健與免疫功能等新藥研發(fā)中都具有相當?shù)臐摿εc良好的應用前景[2,5-8]。本實驗前期采用正交優(yōu)化設計法得到不同商品酶解大鯢體表黏液的最佳酶解工藝條件，然后探究大鯢不同酶解低聚糖肽的抗血小板聚集、抗菌等生物活性，為進一步開發(fā)利用大鯢黏液可持續(xù)的生物資源在改善血液循環(huán)障礙、防止血栓形成方面提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鯢黏液，采用無創(chuàng)提取技術獲得(廣州華寶珍稀水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司)；SD大鼠5只，體重(150±15)g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶(北京鼎國生物技術發(fā)展中心)；菌種：金黃色葡萄球菌(Sta.aureus，26112)、大腸埃希菌(E.coli，44113)，菌種均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與試劑

QX-200全血血小板聚集儀(上海醫(yī)大儀器廠)、紫外可見分光光度計、ADP(大連美侖生物技術有限公司)、其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 全血血小板聚集專用稀釋緩沖液配制 NaCl 8.0g，MgCl·6H2O 0.427g，CaCl20.2g，KCl 0.2g，D-glucose1.0g，NaHCO31.5g，NaH2PO4·2H2O 0.065g，Heparin(肝素)2 000U，加0.1%迭氮鈉1mL，5℃保存，與抗凝全血的稀釋比為1∶1，pH=7.4。當發(fā)現(xiàn)溶液混濁或者長霉菌不得使用。

1.3.2 凝聚劑配制 精密稱定ADP約0.0854g，用稀釋緩沖液定容于10mL容量瓶中，即為20mmol/L，精密量取該溶液5mL稀釋并定容成10mL即得10mmol/L聚集劑。

1.3.3 供試品溶液 稱取大鯢黏液粉末樣品研磨成勻漿，稱取約0.5g，用蒸餾水定容至100mL，靜置10～30min過濾，濾液定容至100mL備用。

1.3.4 ADP誘導全血血小板聚集實驗 應用電阻法進行血小板聚集指數(shù)，酶解產(chǎn)物重復3次，取平均值。①用定量儀器取0.5mL抗凝全血再加0.5mL全血稀釋，再加藥物或者對照液350μL，37℃溫育5min，移入攪拌珠；②待溫度穩(wěn)定后，插入鉑絲電極，啟動“攪拌”測定按鍵，調(diào)零定標；③待調(diào)整完畢后，加入5μL ADP誘導劑，同時按下“定時”鍵，5min后鎖定平板，記錄數(shù)值，以最大聚集度(Ω值)表示。

1.3.5 大鯢黏液抑菌活性測定 (1)大鯢黏液抑菌實驗前處理：按照無菌濾膜和滅菌分別處理，并將中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、大鯢黏液多糖的酶解產(chǎn)物分別記錄為ZL、YL、ML、DL、ZR、YR、MR、DR。(2)試管法測定大鯢黏液抑菌活性[12]：以試管法作抗菌強度定量試驗，常規(guī)培養(yǎng)后觀察得到最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。實驗時，用營養(yǎng)肉湯將樣品分別稀釋，從1∶2.5開始稀釋(即1份樣品加1.5份營養(yǎng)肉湯)。每排藥液的各個濃度管及空白對照管分別加入1∶2 000的試驗菌液(8h培養(yǎng)物)0.1mL，37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。判定最小抑菌濃度(MIC)，MIC是指完全抑制試驗菌種生長所含的最低藥物濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鯢黏液低聚糖肽體外對ADP誘導全血血小板聚集實驗

不同酶解產(chǎn)物均對ADP誘導的聚集血小板有抑制作用，且兩兩間抑制效果不同(F=4.618，P=0.027<0.05)。通過LSD多重比較分析可知，木瓜蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解與空白血樣組差異顯著(P=0.036、P=0.007)，而中性蛋白酶酶解未達到顯著水平(P=0.083>0.05)。三種酶解產(chǎn)物與阿司匹林組抑制血小板聚集相比差異并不顯著。詳見表1。

表1 低聚糖肽體外對ADP誘導全血血小板聚集實驗 (±s)

注：與阿司匹林比較，*P<0.05。

2.2 大鯢黏液低聚糖肽體外抑菌實驗

采用對倍稀釋試管法?？咕鷮嶒灠幢?實施，以1～9管均含有倍比稀釋的藥液，逐一加入菌液、肉湯等，并將實驗材料充分混勻后，培養(yǎng)24h，觀察實驗結(jié)果。藥液對照管以第9管無細菌生長，菌液對照管第10管有細菌生長，實驗方為有效。以抑制試驗菌生長的藥液最高稀釋度為該藥液對該試驗菌的抗菌效價。以能抑制試驗菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度MIC。

4種無菌濾膜處理以及4種高溫滅菌在1∶2.5濃度以及以下稀釋液均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌沒有明顯的抑菌效果。結(jié)果見表3。

表2 大鯢黏液抗菌實驗

注：菌液為8h肉湯培養(yǎng)物，1∶2 000稀釋，混勻后37℃培養(yǎng)，24h觀察結(jié)果。

表3 8種處理液抗菌效價

表3內(nèi)數(shù)字代表抗菌效價，以能抑制試驗菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度MIC，而>1∶2.5表示在此濃度下實驗沒有抑菌作用?？瞻讓φ展艿脑囼灳N生長正常。

3 討論

3.1 ADP誘導全血血小板聚集實驗

血小板聚集實驗研究中為了使得檢測結(jié)果能夠更加反映體內(nèi)狀態(tài)和情況，采用電阻法進行測定。電阻法系根據(jù)血小板聚集在電極上增厚使電阻增大的原理，動態(tài)反映血小板聚集的全過程[13]。實驗結(jié)果表明:大鯢黏液低聚糖肽能夠在體外抑制ADP誘導的血小板聚集作用，且胰蛋白酶、木瓜蛋白酶抑制效果顯著。推測原因是大鯢低聚糖肽與ADP相互作用鍵合，從而阻礙了ADP與細胞表面受體結(jié)合。本實驗血小板聚集研究結(jié)果與馮敘橋等[9]研究結(jié)果相似。

大鯢黏液低聚糖肽抗血小板聚集作用研究為臨床用于血栓栓塞性疾病的治療提供了一定的實驗和理論依據(jù)，同時可能對伴有血小板聚集性增高的高血壓、動脈粥樣硬化的防治有一定的臨床價值。

3.2 試管法研究體外抑菌作用

實驗結(jié)果提示大鯢黏液以及酶解產(chǎn)物均無抗菌作用。研究結(jié)果與陳德經(jīng)等人的研究報道不一致。陳德經(jīng)等人[10]研究顯示大鯢皮膚對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有明顯的抑菌效果，抑菌力分別為157.1%、90.7%、78.1%，而對大腸桿菌沒有抑制作用。皮膚黏液、大鯢肉、大鯢油對四種菌均無抑制作用，說明大鯢的主要抗菌部位為皮膚。

通過比較文獻對大鯢黏液的處理，結(jié)合抗菌肽物質(zhì)作為蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其作用機制，推測本實驗研究方法中采用酶解法可能將具有抗菌物質(zhì)的多肽活性成分破壞，同時采用無菌濾膜也可能將抗菌肽物質(zhì)阻隔在濾膜中。另外，抗菌肽活力及其穩(wěn)定性易受到蛋白酶、電解質(zhì)、pH變化的影響，從而導致其抗菌作用波動大[15]。

綜上所述，大鯢黏液酶解產(chǎn)物抑菌效果需要通過實驗進一步證實，而大鯢低聚糖肽具有顯著抑制血小板聚集作用，但需要進一步研究低聚糖肽抗血小板聚集機制，以期發(fā)現(xiàn)預防血栓性疾病的藥物先導物，進而為大鯢黏液的天然藥物開發(fā)利用打下基礎。

[1] 劉國鈞.我國的稀有珍貴動物——大鯢[Z].1989:43-45.

[2] 楊志偉,郭文韜,黃世英,等.人工養(yǎng)殖大鯢肉延緩黑腹果蠅衰老的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(4):265-266.

[3] 王文莉,張偉,于新瑩,等.大鯢肉酶解產(chǎn)物的制備及其抗氧化性的研究[J].河北漁業(yè),2012(9):1-4.

[4] 陳曦,王楊科,陳德經(jīng).大鯢皮膚和黏液抑菌效果及其中藥膏制劑對燙傷的影響[J].中藥藥理與臨床,2012(5):113-116.

[5] 曹潔,余龍江,崔永明,等.純大鯢粉對小鼠抗疲勞作用及免疫功能的影響[J].四川動物,2008,27(1):149-152.

[6] 黃正杰,崔建云,任發(fā)政,等.大鯢粗提物延緩秀麗線蟲衰老的研究[J].食品工業(yè),2013,34(1):122-125.

[7] 曲敏,閆欣,李偉,等.大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J].北京農(nóng)學院學報,2012,27(1):42-44.

[8] 李偉,于新瑩,佟長青,等.大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(6):91-93.

[9] 馮敘橋,曲敏,于新瑩,等.大鯢低聚糖肽性質(zhì)初步研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(6):128-131.

[10] 陳德經(jīng),陳曦,方斌,等.大鯢不同部位的抑菌效果研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(23):14109-14110.

[11] 王利鋒,李學英,王大忠.大鯢皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究[J].中國生化藥物雜志,2011，32(4):269-272.

[12] 付愛華,張宏貴,張林,等.東北刺人參揮發(fā)油抗真菌實驗及臨床研究[J].中華皮膚科雜志,1997,30(5):310-311.

[13] CARDINAL DC,FLOWAR RJ.The electronic aggregometer :a novel device for assessing platelet behavior in blood[J].J Pharm Meth,1980,8(2):135.

[14] 羅霞,潘厚軍,鞏華,等.鱖皮膚黏液IgM樣蛋白的純化[J].水產(chǎn)學報,2007,31(6):726-730.

[15] CHALEKSON CP, NEUMEISTER MW,JAYNES J, et al. Trearment of infected wounds with the antimicrobial peptide D2A21[J].Trauma,2003,54(4):770-774.

(責任編輯：魏 曉)

Research on the Antiplatelet Aggregation and Antibacterial of the Giant Salamander Mucin Oligosaccharide Peptide

Chen Liping1，Cai Jianxiong2*，Wang Jian1

(1.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China; 2.Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Objective:Make full use of resources of Chinese giant salamander, Studying the giant salamander mucin oligosaccharide peptide on antiplatelet aggregation, antibacterial in vitro activity.Methods:Research on biological activity of the giant salamander mucin oligosaccharide peptide is adopting the whole blood impedance platelet aggregation test and antibacterial in vitro experiment. Results:The Platelet aggregation test: the three enzyme Trypsin, neutral protease and papain products were on inhibition of the ADP induced platelet aggregation. The concentration class were (4.73±2.20),(6.80±0.98),(6.13±0.76), respectively.The inhibition ratio were 48.98%、26.65%、33.87% separately. The antibacterial activity in vitro experiment: the potency, was more than 1∶2.5, suggesting that the inhibitory effects were not significant. Conclusion:Trypsin and papain enzymolysis products giant salamander mucus has significant effect of anti-platelet aggregation while the giant salamander mucus and its hydrolyses had no inhibitory effect.

Giant Salamander Mucus; Antibacterial; Antiplatelet Aggregation; Biological Activity

2014-08-19

陳麗萍(1994-),女， 廣州中醫(yī)藥大學在讀生。

蔡劍雄(1989-) ，男，上海師范大學工程食品研究所碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學、藥學。

R282.7

A

1673-2197(2015)01-0011-03

10.11954/ytctyy.201501006