王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮穎，袁文慧，萬軍

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心血管病研究

NADPH氧化酶在心力衰竭患者心肌中的基因表達(dá)及其與心肌纖維化關(guān)系的研究

王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮穎，袁文慧，萬軍

目的 探討NADPH氧化酶(Nox)在心力衰竭患者心肌中的基因表達(dá)及其與心肌纖維化的關(guān)系。方法 采用Real-timePCR檢測15例心力衰竭患者(心力衰竭組)和9例心臟移植供體(對照組)左心室心肌組織NoxmRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測Nox及MAPKs信號途徑磷酸化水平，丙二醛(MDA)試劑盒檢測心肌MDA含量，天狼猩紅染色觀察心肌纖維化程度。結(jié)果 與對照組比較，心力衰竭組心肌MDA含量明顯升高，分別為(6.62±0.80)mmol/mgprot和(2.23±0.30)mmol/mgprot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.947，P<0.01)。心肌Nox4mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(t=-3.144，P<0.01)，而Nox2及其亞基表達(dá)水平無明顯變化；心肌纖維化程度明顯增加(t=-12.947、-23.102，P<0.01)，同時MAPKs信號途徑(p38、ERK1/2、JNK)磷酸化水平明顯增加(t=-15.574、-12.434、-30.123，P<0.01)。結(jié)論 心力衰竭患者心肌氧化應(yīng)激水平增加，可能與Nox4表達(dá)增加有關(guān)。Nox4通過激活MAPKs信號途徑參與心肌纖維化過程，抑制Nox4可能降低心力衰竭患者心肌氧化應(yīng)激和纖維化程度。

NADPH氧化酶；心力衰竭；氧化應(yīng)激；心肌纖維化

心力衰竭是多種心血管疾病的終末環(huán)節(jié)，其發(fā)生發(fā)展機制尚不明確。心力衰竭過程中心肌出現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)與功能的變化，包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)、代謝重構(gòu)及神經(jīng)重構(gòu)等。近來的研究提示活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多引起的氧化應(yīng)激在心肌重構(gòu)中起重要作用[1]。心臟組織ROS有以下幾種來源：線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶、解偶聯(lián)的內(nèi)皮一氧化氮合酶和NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)[1，2]。Nox是惟一一類以生成ROS為主要功能的蛋白質(zhì)，心血管系統(tǒng)表達(dá)4種Nox亞型(Nox1、 Nox2、 Nox4和Nox5)，其中心肌細(xì)胞主要表達(dá)Nox2和Nox4[3]。Nox2由胞膜亞基(gp91phox、p22phox)和胞漿內(nèi)亞基(p47phox、p67phox、p40phox)組成，胞漿內(nèi)亞基需與胞膜亞基結(jié)合才能完成Nox2激活過程；而Nox4主要由胞膜亞基(gp91phox、p22phox)組成，其活性變化依賴于Nox4表達(dá)水平。Nox2主要生成超氧陰離子，而Nox4主要催化生成過氧化氫(H2O2)[2]。動物實驗發(fā)現(xiàn)Nox在心肌肥厚、心肌梗死、高血壓病等多種疾病模型中起重要作用，但關(guān)于Nox在心力衰竭患者心肌中的表達(dá)報道甚少。本文通過檢測Nox與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)通路主要成員ERK1/2、JNK、p38在心力衰竭患者左室心肌組織中表達(dá)水平的變化，分析Nox與心肌纖維化的關(guān)系，探討心力衰竭時心肌重構(gòu)的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源： 參照參考文獻(xiàn)[4]的方法收集2012年9月—2014年12月因嚴(yán)重心力衰竭行心臟移植患者的左室心肌組織，15例患者中男10例，女5例，年齡(46.2±9.3)歲，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)為(69.00±12.01)m，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)為(28.00±5.20)%。心力衰竭診斷均符合2012年歐洲心臟病協(xié)會發(fā)布的“心力衰竭診斷及治療指南”[5]。同時收集擬行心臟移植但配型不成功的供體心臟左室心肌組織作為對照組，9例患者均為男性，年齡(38.1±7.7)歲。排除有嚴(yán)重肝腎功能不全、心臟病史患者。心肌組織標(biāo)本均取自左室心尖部，以最大可能保證心肌標(biāo)本的一致性。心肌組織分離后迅速放至液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；擬行病理學(xué)檢測的心肌標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋。

1.1.2 實驗材料： 實時熒光定量PCR檢測儀(Roche，Light Cycler 480)，TRIzol(Roche，11667165001)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，04897030001)，熒光染料(Roche，04707516001)；蛋白/核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYY-6C)，超聲裂解儀(Misonix，XL-2000)，酶標(biāo)儀(Bio-tek，Synergy HT)，Western Blot電轉(zhuǎn)儀(Invitrogen，XCell SureLock)，轉(zhuǎn)膜槽(北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN)。Anti-Nox2、anti-Nox4抗體購自Santa公司，anti-p38、anti-ERK1/2、anti-JNK及其磷酸化抗體購自CST公司，anti-GAPDH抗體購自CST公司；丙二醛檢測試劑盒(A003-1)購于南京建成生物工程研究所，其余常用試劑均購自國藥集團。

1.2 觀測指標(biāo)及方法

1.2.1 丙二醛(MDA)含量檢測： 取心肌組織約100 mg，加入生理鹽水900 μl，利用高通量組織研磨儀獲得組織勻漿，12 000 r/min 4℃離心10 min。離心后取上清，利用BCA法測定上清中蛋白濃度，嚴(yán)格按說明書步驟測定MDA水平。

1.2.2 Nox4、Nox2及其亞基mRNA水平檢測： 應(yīng)用Trizol法提取心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用羅氏Light Cycler 480 Real-time PCR儀進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的特異性擴增，選擇GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。Nox4、Nox2及其亞基的特異性引物序列見表1，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性10 min；95°C變性10 s、60°C退火10 s、72°C延伸20 s，共40個循環(huán)。

1.2.3 Nox、ERK1/2、JNK及p38蛋白表達(dá)水平檢測： 取適量心肌組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照40 μg/孔道上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1 h，TBST洗膜后于一抗中4℃孵育過夜，隨后使用相應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h，洗膜后用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參分析Nox及MAPKs信號途徑蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 心肌膠原含量測定： 利用天狼猩紅染色分析心肌組織膠原含量。具體過程如下：將心肌組織石蠟切片置于二甲苯溶液中5 min，重復(fù)3次；相繼經(jīng)過100%、90%、70%的乙醇1次各1 min；用流水沖洗標(biāo)本10 min，沖洗完畢將標(biāo)本置入純水中清洗1 min，再置于0.2%磷鉬酸中1～5 min；將切片擺放于潮濕的染色盒中，滴入數(shù)滴0.1%天狼猩紅苦味酸溶液使其充分與標(biāo)本接觸，染色90 min；充分甩去天狼猩紅苦味酸溶液，再浸入純水中數(shù)次；最后經(jīng)過70%、95%乙醇各30 s，100%乙醇30 s 3次。二甲苯2 min，重復(fù)3次，封片。染色后用光學(xué)顯微鏡拍照，每張切片隨機選取10個視野，使用Image-Pro Plus(Version 6.0)軟件測量膠原面積，從而計算膠原容積百分比(%)，膠原容積百分比=膠原總面積/圖像總面積，取平均值作為最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌MDA蛋白含量比較 通過檢測發(fā)現(xiàn)心力衰竭組患者心肌MDA含量明顯高于對照組[(6.62±0.8)mmol/mgprotvs. (2.23±0.3)nmol/mgprot)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.947，P<0.01)。

2.2 心肌Nox2和Nox4基因表達(dá)水平 與對照組心肌相比，心力衰竭組患者心肌Nox4mRNA水平明顯上調(diào)(t=-3.144，P<0.01)，而Nox2mRNA及其亞基(p22phox、p47phox、p67phox)基因表達(dá)水平并無明顯變化，見圖1。蛋白表達(dá)水平同樣證實心力衰竭組Nox4蛋白表達(dá)較對照組增加(t=-4.614，P<0.01)，而Nox2蛋白水平無明顯，見圖2，3。

注：與對照組比較，aP<0.05

圖2 2組Nox2、Nox4蛋白電泳圖

注：與對照組比較，aP<0.01

2.3 心肌纖維化程度 天狼猩紅染色反映心肌纖維化程度，顯微鏡下可見對照組膠原纖維散在分布于心肌間質(zhì)；而心力衰竭組心肌間質(zhì)中出現(xiàn)大量膠原纖維，且膠原纖維增粗，排列紊亂(圖4見封3)，膠原容積百分比明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-23.102，P<0.01)，見圖5。

注：與對照組比較，aP<0.01

2.4MAPKs信號通路磷酸化水平MAPKs信號通路在纖維化過程中起重要作用，WesternBlot結(jié)果顯示心力衰竭組MAPKs的3個家族成員p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均較對照組明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-15.574，P<0.01；t=-12.434，P<0.01；t=-30.123，P<0.01)，見圖6、圖7。

圖6 2組MAPKs信號通路主要成員電泳圖

3 討 論

ROS通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程維持心臟正常功能，而ROS生成增多引起的氧化應(yīng)激參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。心臟組織中ROS有多種來源，如線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶和Nox等。與其他氧化酶類不同，Nox是目前已知的惟一一種以催化生成ROS為主要功能的蛋白質(zhì)，不具有其他生物功能[6]。因此，明確Nox在心力衰竭患者心肌中的表達(dá)變化具有重要意義。

注：與對照組比較，aP<0.01

MDA水平間接反映心肌氧化應(yīng)激程度，我們的研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者心肌MDA水平增加，提示心肌氧化應(yīng)激水平增加。既往研究提示心力衰竭患者心肌Nox活性增加，但由何種Nox亞型引起尚無定論[7，8]。Nox4處于持續(xù)激活狀態(tài)，其活性受Nox4表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，我們發(fā)現(xiàn)在心力衰竭患者心肌中Nox4表達(dá)增加，而Nox2及其亞基水平無明顯變化，因此Nox4表達(dá)水平的增高可能是心肌Nox活性上調(diào)的主要原因。Nox2的激活需要胞漿內(nèi)亞基向胞膜轉(zhuǎn)移，與胞膜亞基結(jié)合才能完成，我們并未發(fā)現(xiàn)Nox2及其胞漿內(nèi)亞基表達(dá)水平的變化，但Nox2胞漿內(nèi)亞基是否出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)位置的變化從而使Nox2活性增加尚需進(jìn)一步研究。

Nox4通過不同途徑參與纖維化過程。首先Nox4可以通過ERK途徑調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞遷移和基質(zhì)金屬蛋白酶2、9表達(dá)[9，10]，參與血管緊張素II(angiotensinII，AngII)引起的心肌纖維化。同時，Nox4在成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞過程中起重要作用[11，12]，Nox4介導(dǎo)了成纖維細(xì)胞向其活化形式肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其合成和分泌膠原能力增加，促進(jìn)纖維化過程。另外，Nox4還可以通過Smad3和JNK途徑促進(jìn)結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的表達(dá)，從而參與纖維化過程[13]。過表達(dá)Nox4可以加劇AngII引起的ROS水平和間質(zhì)纖維化，而使用Nox4/Nox1抑制劑可以改善心肌氧化應(yīng)激水平和心臟重構(gòu)[14]。

心力衰竭組患者心肌纖維化程度較對照組明顯增加，天狼猩紅染色發(fā)現(xiàn)心肌膠原含量明顯增多。MAPKs主要包括3個家族成員p38、JNK和ERK1/2，屬于氧化還原敏感性蛋白激酶。MAPKs通路可以被TGF-β激活，作為受TGF-β調(diào)控的非經(jīng)典纖維化通路，MAPKs激活后可以促進(jìn)纖維連接蛋白和膠原合成，參與多種疾病的纖維化過程。

ROS參與多種心血管疾病病理生理過程，ROS的作用高度依賴于ROS的來源、存在的部位、局部濃度，甚至與ROS種類相關(guān)[1，15]。本結(jié)果顯示心力衰竭患者心肌氧化應(yīng)激水平增加，可能與Nox4表達(dá)增加有關(guān)。Nox4活性增強使ROS生成增多，促進(jìn)p38、ERK1/2和JNK磷酸化，使得膠原合成增加，進(jìn)而參與心肌纖維化過程。通過干預(yù)Nox4可能降低心力衰竭時氧化應(yīng)激和心肌纖維化程度，改善心肌重構(gòu)。

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4 王夢龍,萬軍,劉劍芳,等.IL-10在心力衰竭患者心肌中的表達(dá)及其與心肌氧化應(yīng)激關(guān)系的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2014,43(10):103-106.

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Expression of NADPH oxidase in heart failure patients and its relationship with myocardium fibrosis

WANGMenglong,LIUJianfang,LIUMenglin,FENGYing,YUANWenhui,WANJun,DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

WANJun,E-mail:wanjun1963@126.com

Objective To investigate the relationship between NADPH oxidase (Nox) expression and myocardial fibrosis in heart failure patients.Methods Using Real-time PCR to detect left ventricular myocardium of Nox mRNA expression level in 15 cases with congestive heart failure (CHF group) and 9 cases of cardiac transplantation donor (control group). Western blot was used to detect Nox and MAPKs signaling pathway phosphorylation level, malondialdehyde (MDA) kit for the detection of myocardial MDA content and Sirius red staining to observe the degree of myocardial fibrosis.Results Compared with the control group, in heart failure group, the myocardial MDA content increased significantly, (6.62±0.80) mmol/mgprot and (2.23±0.30) mmol/mgprot respectively, the difference has statistical significance (t=-12.947,P<0.01).MyocardialNox4mRNAexpressionlevelsweresignificantlyup-regulated(t=-3.144,P<0.01),Nox2anditssubunitexpressionlevelhadnoobviouschange;thedegreeofmyocardialfibrosiswassignificantlyincreased(t=-12.947,t=-23.102,P<0.01),andphosphorylationlevelsofMAPKssignalpathway(p38,ERK1/2andJNK)significantlyincreased(t=-15.574,t=-12.434,t=-30.123,P<0.01).Conclusion The heart failure with myocardial oxidative stress increase may upgrade the expression of Nox4. Nox4 is involved in myocardial fibrosis by activating MAPKs pathway, and inhibiting Nox4 may reduce myocardial oxidative stress and fibrosis in patients with heart failure.

NADPH oxidase; Heart failure; Oxidative stress; Myocardial fibrosis

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81170208)；湖北省科技研究與開發(fā)項目(鄂財企發(fā)[2008]113號)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

萬軍，E-mail:wanjun1963@126.com

2015-04-14)

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.07.005