摘要：目的 通過檢測SDF-1在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)，分析其與患者臨床病理特點的關(guān)系，進(jìn)而推論SDF-1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演的角色。方法 用RT-PCR和免疫組化法檢測52例診斷明確的胃癌患者的SDF-1在胃癌組織以及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理特點進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果 免疫組化方法測得，胃癌組織中SDF-1蛋白的陽性率顯著高于癌旁組織，分別為94.2%和5.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RT-PCR測得SDF-1基因在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。胃癌組織中SDF-1基因的表達(dá)在HP陽性胃癌患者中的表達(dá)顯著高于HP陰性胃癌患者；在分期較晚、浸潤深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多及分化程度較差的胃癌患者中的表達(dá)顯著高于分期早，浸潤深度越淺、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越少以及分化程度較好的胃癌患者（P均<0.05）；其表達(dá)水平與腫瘤位置、患者性別、年齡以及術(shù)前外周血CEA、CA19-9水平不相關(guān)（P均>0.05）。結(jié)論 SDF-1基因和蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織，提示其可能在胃癌的發(fā)生過程中作為一種致癌基因扮演著重要角色；HP感染增強SDF-1的致癌作用，SDF-1可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)，但不能作為推測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：SDF-1；胃癌；病理學(xué)特征；幽門螺旋桿菌

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全球每年有超過90萬的新確診病例和大約70萬的胃癌患者死亡[1]。在我國其發(fā)病率和死亡率占各種消化系統(tǒng)惡性腫瘤之首。從基因水平研究胃癌的發(fā)生發(fā)展對提高胃癌的治療效果具有重要意義?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1，又稱CXCL12），是CXC趨化因子家族的成員，其與受體CXCR4結(jié)合參與機體造血、干細(xì)胞生成、白細(xì)胞浸潤、神經(jīng)、血管和心臟的形成以及HIV感染等一系列生理病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1與多種腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2-4]。本研究采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）以及免疫組織化學(xué)的方法，檢測胃癌組織和癌旁正常組織中SDF-1的表達(dá)，探討SDF-1與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，研究其與胃癌增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，判斷SDF-1基因能否作為預(yù)后及推測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

1資料與方法

1.1一般資料 收集2011 年4～7月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科的胃癌手術(shù)標(biāo)本（包括癌組織和癌旁6 cm以上胃黏膜組織）52例，含男41例，女11例；年齡31～79歲，平均（58.6±11.7）歲。據(jù)NCCN 2012 版胃癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[5]：Ⅰ期15 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期10 例。據(jù)NCCN 2012 版胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級標(biāo)準(zhǔn)[5]：N0 20 例，N1 10 例，N2 14 例，N3 8 例。腫瘤分化程度：高分化癌2 例，中分化癌14 例，低分化癌36 例。腫瘤部位：胃上1/3者13例，中1/3者14例，下1/3者25例。據(jù)UICC1997年公布的胃癌TNM分期法[6]，T1：10例，T2：10例，T3：32例。所有病例均經(jīng)術(shù)前胃鏡活檢和術(shù)后病理學(xué)檢查證實為胃癌，且近期均未服用過抗幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）藥物或行放化療治療。

1.2主要試劑與儀器 TRNzol，天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；免疫組織化學(xué)SDF-1一抗（單克隆，鼠抗人）及免疫組織化學(xué)二抗試劑盒，ABCAM 公司；DAB 試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；定量PCR 儀，ABI 公司。

1.3 HP檢測 14C-尿素呼吸試驗兼簡單、快速以及價廉于一體，靈敏度>95%，特異度高于90%，為HP感染的一線定性診斷方法[7]。本研究術(shù)前即采用14C-尿素呼吸試驗的方法檢測患者HP值，<100 dpm為陰性，≥100 dpm為陽性。有11例患者因胃食管結(jié)合部完全梗阻而未做此項檢查。

1.4 RT-PCR 法檢測SDF-1 基因的表達(dá)

1.4.1總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 剪取一定量的組織，用液氮研成粉末后按比例加入TRNzol，按TRNzol說明書進(jìn)行總RNA的提取，用焦炭酸二乙酯處理后的水（簡稱DEPC水）溶解RNA，并檢測RNA的質(zhì)量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.2 RT-PCR 檢測SDF-1和β-actin引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小，見表1。反應(yīng)體系及擴增條件見表1。2-△Ct為基因的相對表達(dá)量，其中△CT 為RT-PCR 檢測SDF-1 所得的CT 值與檢測β-actin 所得的CT 值之差?！鰿T 值越高，基因表達(dá)越低。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測SDF-1蛋白的表達(dá) 切烤片，依次置二甲苯溶液、無水乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇，0.01MPBs（PH7.4）漂洗；3%過氧化氫溶液室溫避光封閉；置枸櫞酸溶液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)；滴加一抗，二抗；滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗藍(lán)化；吹干，封片。用非腫瘤患者正常胃黏膜組織作為陽性對照，用PBS 代替一抗作為陰性對照[8]。

陽性結(jié)果判定根據(jù)以下兩方面的總分進(jìn)行判斷：①選染色均勻的陽性表達(dá)腫瘤區(qū)域，5個高倍視野計數(shù)陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞所占百分比為五級計分：陽性細(xì)胞率<5%為0分；陽性細(xì)胞率5%～25%為1分；陽性細(xì)胞率26%～50%為2分；陽性細(xì)胞率51%～75%為3分；陽性細(xì)胞率>75%為4分。②按染色強度來分：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。兩種評分相加，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++），以上方法均由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法獨立檢測，取平均值[9]。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，胃癌與癌旁組織的△Ct值比較采用配對樣本t檢驗，按臨床病理學(xué)特征分組后各組癌組織的△Ct 值兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；免疫組織化學(xué)結(jié)果采用配對χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測SDF-1在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況 SDF-1基因在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，其△Ct 值之差為（-10.74±1.87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.50，P<0.01），見圖1。

圖1 RT-PCR檢測SDF-1基因在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 SDF-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)陽性率為 94.2%（49/52），明顯高于其在癌旁正常組織中的表達(dá)陽性率5.8%（3/52），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2、圖2。

圖2 免疫組化結(jié)果：A胃癌組織 陽性（x200），B 癌旁組織 陰性（x200）

2.3胃癌組織中SDF-1基因表達(dá)與其臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 不同腫瘤分期、分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、浸潤深度以及HP陽性與陰性的胃癌患者，胃癌組織中SDF-1 基因的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。不同性別、年齡、腫瘤部位以及術(shù)前外周血CEA 和CA19-9陽性與陰性的胃癌患者，胃癌組織中SDF-1 基因的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。

3討論

SDF-1由Tashiro首先在P6系小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)克隆的方法分離得到它的cDNA[10]。其基因位于10 號染色體長臂上，SDF-1cDNA長1776bp，屬于趨化因CXC受體家族，編碼的受體為CXCR4，是與G 蛋白耦聯(lián)的部位。國外學(xué)者[11]首先發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，后來在乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、宮頸癌[12]、肺癌[13]等研究中發(fā)現(xiàn)，SDF-1的表達(dá)與腫瘤的生長、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。SDF-1 廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，包括免疫細(xì)胞、腦、心臟、腎、肝、肺和脾，在免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[10，14]。SDF-1 調(diào)控人體多種生理病理過程，包括心臟和神經(jīng)元的發(fā)育、血管發(fā)生、干細(xì)胞遷移、新生血管形成、凋亡和腫瘤發(fā)生。SDF-1與其受體CXCR4 的結(jié)構(gòu)和相互作用機制是發(fā)揮其病理、生理功能的基礎(chǔ)。

有研究[15]發(fā)現(xiàn)，SDF-1的過表達(dá)通過對間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞和上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞擴增，誘導(dǎo)胃黏膜不典型增生。從癌旁胃黏膜→胃癌前病變→早期胃癌→進(jìn)展期胃癌，胃黏膜組織中SDF-1的表達(dá)水平逐漸升高，可見其表達(dá)變化貫穿胃組織癌變的全過程，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。如果能夠通過研究發(fā)現(xiàn)它與胃癌某些病理學(xué)特征的關(guān)系，那么術(shù)前胃鏡下活檢將有助于對腫瘤的初步評估，指導(dǎo)臨床治療，然而類似的研究在國內(nèi)很少。SDF-1的表達(dá)與胃癌外周血CEA 和CA19-9 水平及HP值是否有關(guān)，目前國內(nèi)外研究尚無報道，其與胃癌患者病理學(xué)特征如臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及與患者性別、年齡的關(guān)系，目前國內(nèi)研究也較少，值得我們進(jìn)一步深入研究探討。本研究采用RT-PCR 和免疫組織化學(xué)的方法分別從基因和蛋白質(zhì)兩個水平檢測SDF-1在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)，并結(jié)合患者的臨床資料和腫瘤病理學(xué)特征進(jìn)行比較分析，以期探索上述問題。

本研究結(jié)果顯示，無論在基因還是蛋白質(zhì)水平，胃癌組織SDF-1的表達(dá)均高于癌旁正常組織，從而印證了它是一種致癌基因[2-3，11-13]的結(jié)論。Shibata[15]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)SDF-1轉(zhuǎn)基因小鼠與感染幽門螺桿菌的貓鼠雜交后在致胃癌作用上有協(xié)同效應(yīng)，本研究結(jié)果證實SDF-1基因與HP感染與胃癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，且與腫瘤浸潤深度與分期正相關(guān)，這與Ishigami[16]的研究結(jié)論一致。陳友權(quán)[17]的研究表明SDF-1的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分級呈正相關(guān)，本研究結(jié)果顯示SDF-1的表達(dá)在低分化程度的胃癌患者中顯著高于中高分化程度的胃癌患者；本組結(jié)果亦提示SDF-1基因表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移程度相關(guān)而與腫瘤位置無關(guān)，這與Iwasa[4]的研究結(jié)果吻合。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌患者癌組織中SDF-1基因的表達(dá)與其性別和年齡均無關(guān)，提示SDF-1基因的表達(dá)無性別差異，也不會隨著年齡的增加而增減。CEA和CA19-9檢測值可用于胃癌患者復(fù)發(fā)的評估[18]，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SDF-1基因的表達(dá)與患者術(shù)前外周血CEA 和CA19-9 的水平均無關(guān)。因此推測SDF-不能作為推測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。我們下一步需要隨訪本實驗胃癌患者的復(fù)發(fā)情況，再分析SDF-1基因與患者復(fù)發(fā)的關(guān)系，進(jìn)一步證實SDF-1基因可用于胃癌患者復(fù)發(fā)的評估。另外， SDF-1基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機理目前尚無明確的定論，有待進(jìn)一步深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳階平，裘法祖，吳孟超，等.黃家駟外科學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1450.

[2]車曉波，劉文忠.幽門螺桿菌常用診斷方法的評價[J].中華消化雜志，2002，22（11）：691-693.

[3]陳佳慧，肖江衛(wèi)，任明揚，等.gastrokine 1在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2012，10（10）：1089-1093.

[4]沈曉燕，王紹海，梁銘霖，等.CXCR4 及其配體SDF-1在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究[J].癌癥，2008，27（10）：1044-1049.

[5]陳友權(quán)，于燕妮.胃癌中SDF-1、CXCR4、MMP-2和MMP-9的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2012，28（2）：135-139.

編輯/張燕