噬菌體展示技術(shù)最初是由美國(guó) Missouri 大學(xué)的 Smith創(chuàng)建的，是一種噬菌體表面表達(dá)及篩選技術(shù)[1]。噬菌體展示技術(shù)的原理是以噬菌體為載體將外源蛋白的核酸片段克隆至噬菌體衣殼蛋白基因中，以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面，用固定化的靶分子篩選與外源蛋白親和的噬菌體分子，不能結(jié)合的噬菌體被洗掉，而能結(jié)合的噬菌體被保留下來(lái)并通過(guò)感染大腸桿菌得以擴(kuò)增、富集和篩選[2，3]。本文將概述噬菌體展示技術(shù)的基本原理與類(lèi)型及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

1 噬菌體展示技術(shù)的類(lèi)型

1.1 絲狀噬菌體展示技術(shù)： 絲狀噬菌體展示是最早開(kāi)發(fā)的噬菌體展示系統(tǒng)，技術(shù)最為成熟，蛋白質(zhì)借助該系統(tǒng)展示需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜分泌，因此對(duì)于難以分泌的蛋白質(zhì)較難展示，并且該噬菌體衣殼基因的 N 端融合外源蛋白質(zhì)的容量也有限。絲狀噬菌體是單鏈環(huán)狀 DNA 病毒，其基因組為6.4 kb，共編碼10個(gè)不同的蛋白質(zhì)。在絲狀噬菌體的10個(gè)蛋白質(zhì)中，與表面展示有關(guān)的蛋白質(zhì)主要是由基因Ⅲ（ g3） 和基因Ⅷ（ g8） 編碼的外殼蛋白gp3和gp8，分別構(gòu)成 gp3和gp8 展示系統(tǒng)。gp3 和gp8 蛋白的N 端均游離在外，外源蛋白通過(guò)柔性接頭分別與其N(xiāo)端連接，融合蛋白即可展示外源蛋白的構(gòu)象。gp3 和 gp8 展示系統(tǒng)的差別在于：①融合外源蛋白大小的能力不同。gp3 可融合較大的外源肽段，大至50kDa 的蛋白質(zhì)已被成功展示，而 gp8 分子量較小，只能融合較小的外源肽，如五肽或六肽，攜帶肽段太大會(huì)影響外殼的組裝。②拷貝數(shù)不同，gp8的拷貝數(shù)極多，接近3000個(gè)，gp3的拷貝數(shù)僅3～5個(gè)，但可以減少多價(jià)結(jié)合，故可用于選擇高親和力的配體，制備人工疫苗則選擇 gp3 作為融合部位更為合適[4]。

1.2 λ噬菌體展示技術(shù) λ噬菌體是最早使用的克隆載體，其兩端為不閉合的線形雙鏈 DNA，末端為長(zhǎng)12個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈。λ噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白質(zhì)與λ噬菌體的主要尾部蛋白PV或λ噬菌體頭部裝飾蛋白D融合而被展示的。與絲狀噬菌體比較而言，λ噬菌體表達(dá)蛋白是在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝后再釋放而不必通過(guò)分泌途徑，因此它對(duì)展示的肽或蛋白質(zhì)的大小沒(méi)有限制。成熟的λ噬菌體顆粒有兩個(gè)結(jié)構(gòu)單位，即頭部D蛋白區(qū)域和尾部PV蛋白區(qū)域組成，D蛋白是λ噬菌體頭部組裝必需的蛋白，其分子量為11 kDa，有405個(gè)拷貝 [5]。λ噬菌體的尾部蛋白PV為管狀結(jié)構(gòu)，分子量為25.8 kDa，有192個(gè)拷貝。PV蛋白有兩個(gè)折疊區(qū)域其C端的折疊區(qū)域和D蛋白的N端區(qū)域可供外源序列插入或替換。這兩個(gè)基本展示位點(diǎn)均是多拷貝，而且適合展示低親和力和分子量較大的蛋白質(zhì)分子，特別適合用于文庫(kù)的構(gòu)建[6]。

1.3 T4 噬菌體展示技術(shù) T4噬菌體展示技術(shù)是上世紀(jì)80代末期建立起來(lái)的一種展示技術(shù)。性質(zhì)完全不同的外源蛋白質(zhì)可展示與T4噬菌體的衣殼蛋白SOC的C端和HOC的N端，是一種雙展示系統(tǒng)，這兩種蛋白質(zhì)不是T4噬菌體復(fù)制所必需的蛋白質(zhì)，而且借助這兩個(gè)位點(diǎn)因與噬菌體顆粒的親和力高表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，因此避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失[7]。T4噬菌體展示的蛋白質(zhì)常常是在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行裝配，不需通過(guò)分泌途徑進(jìn)行分泌，因而對(duì)展示的多肽或蛋白質(zhì)的大小沒(méi)有太大的限制，其拷貝數(shù)高，在分析抗原表位、細(xì)胞因子、受體及生物工程學(xué)等方面有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力[8]。但由于其采用的是C 端融合，這對(duì)研究蛋白質(zhì)N 端的功能不適合，而使它在蛋白質(zhì)生物研究中的應(yīng)用受到局限[9，10]。

2 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、人源單克隆抗體的制備、藥物篩選和疫苗研制等研究領(lǐng)域，近年來(lái)其在腫瘤診斷和治療方面越來(lái)越發(fā)揮著重要作用[11～14]。

2.1 展示與熒光分子結(jié)合的腫瘤相關(guān)抗原肽，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織可視化。通過(guò)噬菌體對(duì)與熒光分子結(jié)合的腫瘤相關(guān)蛋白的展示，可以在體實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生全過(guò)程的可視化，為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供新途徑。與過(guò)去應(yīng)用放射性標(biāo)記抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤的可視化相比，應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原肽實(shí)現(xiàn)腫瘤的可視化抗原肽分子比抗體小因此的無(wú)免疫原性，更容易滲透到組織、更容易擴(kuò)散、可視性效果更好[15～17]。Dickinson應(yīng)用生物素將IAGLATPGWSHWLAL這種前列腺癌的相關(guān)的15個(gè)蛋白質(zhì)寡肽進(jìn)行標(biāo)記并在熒光顯微鏡下成功的實(shí)現(xiàn)了前列腺癌的可視化[18]。Luna在應(yīng)用CPIEDRPMC這個(gè)9個(gè)氨基酸的寡肽成功的實(shí)現(xiàn)了對(duì)HT29、CaCo-2、RKO、SW480和DLD-1五種腫瘤細(xì)胞在體腫瘤的可視化[19]。將腫瘤特異性抗原肽與熒光分子結(jié)合，不僅可研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，由于其上鏈接有熒光分子在熒光顯微鏡下觀察到腫瘤組織的影像，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的在體診斷。Konkalmatt以胰腺癌細(xì)胞為靶細(xì)胞利用噬菌體展示庫(kù)篩選的特異性六肽，熒光顯微結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)經(jīng)熒光索標(biāo)記的六肽能與胰腺癌細(xì)胞特異性結(jié)合而不與正常組織結(jié)合，可用于胰腺癌的早期診斷[20]。

2.2 篩選腫瘤差異性抗原肽，用于靶向治療 通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出正常組織和腫瘤組織差異性抗原肽，從而在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織和癌癥組織的區(qū)分。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)相關(guān)的腫瘤抗原，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)可以篩選出與這些抗原結(jié)合的配體表位肽，篩選出來(lái)的配體肽段與抗體相比特異性更強(qiáng)、親和力更大，而且這些配體肽段可在體外進(jìn)行化學(xué)合成因此獲取的量可遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于制備抗體的量。這些配體表位肽能夠與腫瘤抗原特異性的結(jié)合，因此其同抗體一樣與腫瘤抗原結(jié)合后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及產(chǎn)生ADCC效應(yīng)發(fā)揮其抗腫瘤的作用。目前通過(guò)噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)篩選出與HER neu、EGFR、Hepsin、Tie2 GRP78、CD21等配體表位肽。這些配體表位肽與腫瘤抗體相比突出特點(diǎn)是能夠避免被內(nèi)皮系細(xì)胞吞噬，因此其在腫瘤靶向治療中將展示出廣闊的應(yīng)用前景[21，22]。

2.3 篩選腫瘤治療性相關(guān)肽，抑制腫瘤生長(zhǎng) 通過(guò)噬菌體展示技術(shù)可以篩選出在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用的蛋白質(zhì)，例如促進(jìn)血管生成的蛋白質(zhì)、促進(jìn)腫瘤發(fā)生和侵入的蛋白質(zhì)，而抑制這些腫瘤發(fā)展過(guò)程對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)。Joshi報(bào)道NPNWGPR可以與腺癌組織特異結(jié)合，在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長(zhǎng)[23]。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選的HTMYYHHYQHHL小肽可以結(jié)合激酶的受體，研究表明其可70%實(shí)現(xiàn)對(duì)移植乳腺癌腫瘤的抑制作用，53%抑制肺轉(zhuǎn)移[24]。Roth的研究顯示CGNKPTRGC小肽與腫瘤淋巴管結(jié)合抑制腫瘤生長(zhǎng)[25]。

噬菌體展示技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤抗原表位鑒定、腫瘤抗原抗體庫(kù)的建立、蛋白分子的相互識(shí)別、抗腫瘤藥物的研發(fā)與篩選、早期癌癥的分子影像學(xué)診斷和治療研究等方面，相信該技術(shù)將在腫瘤研究中發(fā)揮更重要。隨著生物學(xué)研究對(duì)腫瘤靶向蛋白配體的不斷探索，腫瘤靶向治療因其較低的不良反應(yīng)及良好的療效，能夠明顯提高患者的生活質(zhì)量，代表著腫瘤治療的未來(lái)趨勢(shì)，將來(lái)的腫瘤治療模式將是以分子生物學(xué)診斷為基礎(chǔ)的綜合性靶向治療。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)在多種把向腫瘤多肽配體研究中發(fā)揮了重要作用，目前有研究報(bào)道：在體外已成功篩選出針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞如肺癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞以及急性髓性自血病細(xì)胞等特異性結(jié)合肽，這在腫瘤的診斷、靶向治療等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3展望

噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)新近出現(xiàn)的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)可以將不同的基因型和表現(xiàn)型有效地聯(lián)系起來(lái)，噬菌體展示技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、人源單克隆抗體的制備、藥物篩選和疫苗研制以及疾病的診斷和治療等研究領(lǐng)域。噬菌體展示技術(shù)必將成為后基因組時(shí)代的功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的強(qiáng)有力工具。

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