摘要：雪膽內(nèi)生細(xì)菌KLXD06具有抗耐甲氧西林金色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的能力。通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽成分的篩選確定KLXD06最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。研究結(jié)果表明， KLXD06的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、C6H5Na3O7·2H2O 2.0 g/L，K2HPO4 ·3H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L為最佳無(wú)機(jī)鹽組合。

關(guān)鍵詞：雪膽 內(nèi)生細(xì)菌 發(fā)酵 培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-0748（2015）08-0000-00

雪膽（Hemsleya sinesis Cogn）為葫蘆科雪膽屬植物，別名又叫金龜蓮、金盆、羅鍋底[1]，具有廣泛的藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-5]。

近年來(lái)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一，世界各地MRSA的檢出率有增長(zhǎng)趨勢(shì)，有些醫(yī)院甚至發(fā)生暴發(fā)流行[6]。

課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究中，從雪膽內(nèi)生細(xì)菌中篩選到25株內(nèi)生細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗MRSA活性，菌株KLXD06抗MRSA活性最強(qiáng)，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)MRSA仍具有較強(qiáng)的抗菌活性[8]。為了確定KLXD06的最佳發(fā)酵條件，筆者對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源進(jìn)行了篩選，對(duì)無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種

內(nèi)生細(xì)菌KLXD06由本課題組前期實(shí)驗(yàn)分離篩選獲得，具有較強(qiáng)抗MRSA活性。MRSA菌株由峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所提供。

1.2 碳源優(yōu)選實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉等不同的碳源替代葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，在pH為7.0、28℃、180 r/min條件下對(duì)MRSA振蕩培養(yǎng)1 d，然后在平板表面已經(jīng)涂布并晾干的MRSA指示菌液，在平板上距離平板中心1.5 cm處放入牛津杯，分別吸取KLXD06發(fā)酵液100 μL加入牛津杯，再將平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，優(yōu)選出合適的碳源。每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 氮源優(yōu)選實(shí)驗(yàn)

以葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素等不同的氮源替代葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中的硫酸銨，其他成分不變，在pH為7.0，28℃和180 r/min條件下對(duì)MRSA振蕩培養(yǎng)1 d，然后在平板表面已經(jīng)涂布并晾干的MRSA指示菌液，在平板上距離平板中心1.5 cm處放入牛津杯，分別吸取KLXD06發(fā)酵液100 μL加入牛津杯，再將平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，優(yōu)選出合適的氮源。每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 無(wú)機(jī)鹽成分的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化好碳源和氮源的基礎(chǔ)上，參照葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基，固定其他成分，用無(wú)機(jī)鹽C6H5Na3O7·2H2O（A′），K2HPO4·3H2O（B′），F(xiàn)eSO4·7H2O（C′），MgSO4·7H2O（D′）代替葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基中相應(yīng)的無(wú)機(jī)鹽，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。在pH為7.0，28℃和180 r/min條件下對(duì)MRSA進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)1 d，然后接入到裝有牛津杯的涂布有MRSA的平板中，靜置培養(yǎng)1 d后計(jì)算抑菌率。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源的篩選

培養(yǎng)基碳源單因子的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉這4種碳源中，該菌最容易利用葡萄糖和蔗糖，而對(duì)麥芽糖和淀粉的利用效果較差。因此，培養(yǎng)該菌時(shí)，適宜選擇葡萄糖和蔗糖作為該菌培養(yǎng)基的碳源。

2.2 培養(yǎng)基氮源單因子的篩選

培養(yǎng)基氮源單因子的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，硫酸銨作為氮源利用效果最好，其次是硝酸銨，硝酸鈉效果次之，尿素作為氮源的利用效果較差。因此，適宜選擇硫酸銨作為該菌培養(yǎng)基的氮源。

2.3 無(wú)機(jī)鹽成分的優(yōu)化

培養(yǎng)基中各種無(wú)機(jī)鹽成分優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的用量對(duì)菌株KLXD06的生長(zhǎng)均產(chǎn)生一定影響，從極差R′來(lái)看，無(wú)機(jī)鹽作用的主次順序都是A′>B′>C′>D′，即C6H5Na3O7·2H2O對(duì)該菌增殖的影響最為顯著，其次是K2HPO4 ·3H2O，而FeSO4·7H2O和MgSO4·7H2O的影響相對(duì)較小。以KLXD06發(fā)酵液對(duì)MRSA的抑菌率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，水平選優(yōu)得到最優(yōu)組合為A′2B′3C′3D′1，而組合選優(yōu)得到最優(yōu)組合均為A′2B′3C′1D′2，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水平選優(yōu)A′2B′3C′3D′1的抑菌率為32.8%。比較水平選優(yōu)與組合選優(yōu)，最終選取第6號(hào)因素水平A′2B′3C′1D′2，即C6H5Na3O7·2H2O 2.0 g/L，K2HPO4 ·3H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，由此確定該組合為無(wú)機(jī)鹽成分最佳組合。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)以前期實(shí)驗(yàn)雪膽內(nèi)生細(xì)菌中分離篩選到的抗MRSA能力較強(qiáng)的菌株KLXD06為材料，對(duì)其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果表明， KLXD06的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是葡萄糖或蔗糖為碳源，硫酸銨為氮源、C6H5Na3O7·2H2O 2.0 g/L，K2HPO4 ·3H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L為最佳無(wú)機(jī)鹽組合。

微生物的生長(zhǎng)受多種物理、化學(xué)因素的影響和調(diào)節(jié)，培養(yǎng)基成分僅是眾多影響因素之一，要獲得菌株KLXD06的最佳發(fā)酵條件，還需要進(jìn)一步對(duì)接種菌齡、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、通氣量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等發(fā)酵因素進(jìn)行優(yōu)化篩選。

參考文獻(xiàn)

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收稿日期：2015-03-10

資助基金：四川省教育廳資助科研項(xiàng)目（No. 15TD0026），樂(lè)山師范學(xué)院資助科研項(xiàng)目（No. Z1160）

作者簡(jiǎn)介：李金洋（1995—），男，四川巴中人，樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2014級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生；陶磊（1996—），男，內(nèi)蒙古包頭人，樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2014級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生。