摘要：?；撬崾且环N帶有氨基的磺酸，是人體所需營養(yǎng)成分之一。目前，牛磺酸廣泛應(yīng)用于乳制品、飲料、復(fù)合味精、豆制品、滋補品、營養(yǎng)液，還可用于水產(chǎn)、動物養(yǎng)殖飼料添加劑，洗滌劑中間體和化學劑等。它也是魚蝦類食品風味形成的呈味氨基酸。半胱氨酸雙加氧酶是牛磺酸生物合成的兩個限速酶之一，在牛磺酸的合成中起關(guān)鍵作用。本研究利用race PCR技術(shù)克隆到了凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的半胱氨酸雙加氧酶 （L. vannamei cysteine dioxygenase， LvCDO）基因的全長序列，對其編碼的蛋白的特性進行了分析。同時構(gòu)建原核表達載體對其進行表達，獲得可溶表達的LvCDO，并利用GST瓊脂糖凝膠對其進行純化，獲得較純的重組GST-LvCDO。另外還發(fā)現(xiàn)在鹽度為15‰的養(yǎng)殖水體中， LvCDO在凡納濱對蝦的血淋巴細胞和肝胰腺細胞中有較高的轉(zhuǎn)錄水平，表明其調(diào)節(jié)滲透壓方面具有一定功能。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦 ?；撬?半胱氨酸雙加氧酶 克隆 表達

中圖分類號：Q781 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）08-0000-00

Abstract：Taurine is one of the necessary nutrients for animal. At Nowadays， taurine is widely used in dairy products， beverage， composite monosodium glutamate， bean products， tonic， nutrient solution， animal/aquaculture feed additive， animal， intermediates and chemical agents. It is also the delicious amino acid of fish and shrimp. Cysteine dioxygenase is one of the rate limiting enzyme in the biosynthesis of taurine. In this study， full-length of Litopenaeus vannamei cysteine dioxygenase gene （LvCDO） was obtained by race PCR. And then the characteristics of the LvCDO were analyzed. At the same time， prokaryotic expression vector was constructed to get soluble expression LvCDO， and it was purified by GST agarose. We also found that LvCDO was upregulated upon osmotic stress in haemocytes and hepatopancreas of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vanname； taurine； cysteine dioxygenase； clone； expression

?；撬幔═aurine）是一種在動物界分布廣泛的非蛋白氨基酸，在維持人體大腦正常生理功能、促進嬰幼兒大腦的發(fā)育、維持正常的視覺功能、促進膽汁酸鹽代謝、參與內(nèi)分泌活動及提高人體免疫力等多個方面有重要功能[1-3]。近年來因作為嬰幼兒食品及功能性飲料的營養(yǎng)添加劑而受到廣泛關(guān)注[4-5]。

現(xiàn)有的研究表明水產(chǎn)動物一般含有較高濃度的牛磺酸，而水產(chǎn)動物所需的牛磺酸主要依靠自身合成或直接從餌料中攝取獲得。魚蝦類食品因此成為人類補充?；撬岬闹匾緩?。不同種類的水產(chǎn)動物內(nèi)源合成?；撬崮芰σ蚱湎嚓P(guān)酶類的活性差異而不同，也因此造成其對外源性牛磺酸的需求的差別[6]。而對于水產(chǎn)動物而言，牛磺酸的生物合成中，最為重要的兩個酶就是半胱次磺酸脫羧酶 （cysteine sulfinate decarboxylase， CSD） 和半胱氨酸雙加氧酶 （cysteine dioxygenase， CDO） [7-9]。凡納濱對蝦是廣受歡迎的一種食用對蝦，除味道鮮美外其也是人體補充?；撬岬囊环N重要食品[10]。然而目前關(guān)于凡納濱對蝦的CDO基因的相關(guān)研究仍未見報道，對其?；撬嵘锖铣蓹C制更是不清楚。為了研究凡納濱對蝦?；撬岷铣傻臋C制，作者克隆了凡納濱對蝦?；撬岷铣傻年P(guān)鍵酶半胱氨酸雙加氧酶 （L. vannamei CDO， LvCDO），并對其功能展開初步研究，為進一步理解凡納濱對蝦?；撬嵘锖铣傻臋C理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli DH5，基因型supE44 lacU169 80 lacZ M15 hsdR recA1 endAgurA1 thi-1 relA1；大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3），基因型F-，ompT，hsdS（rBB-mB-），gal，dcm（DE3）為廣東省食品工業(yè)研究所實驗室保存。質(zhì)粒pMD18為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pGEX-4T-1為廣東海洋大學惠贈。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

主要試劑SMART? RACE cDNA擴增試劑盒、T4 DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、SYBR? Green Master Mix： SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNase H Plus）、SYBR PrimeScript? RT-PCR試劑盒（Perfect Real Time）、T4 DNA Ligase均為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I為FERMENTERS公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為OMEAG公司產(chǎn)品；GST瓊脂糖凝膠為GE公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白Marker為Bio-Rad公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；DNA marker （DL2000） 為東勝生物公司產(chǎn)品，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器

主要儀器設(shè)備LightCycler480熒光定量 PCR 儀：購自德國 Roche 公司；PCR儀為東勝生物公司制造；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；E412951 型凝膠成像儀、EPS-300A 型數(shù)顯雙穩(wěn)電泳儀，上海天能科技有限公司制造；離心機由德國 Eppendorf 公司生產(chǎn)；紫外分光光度計由美國 GE 公司生產(chǎn)；SW-CJ-1F 超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；THZ-C 型恒溫搖床由廣州深華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 LvCDO的race PCR

根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的有關(guān)LvCDO的表達序列標簽序列（expressed sequence tag， EST） FE088656.1，設(shè)計兩條5’race PCR引物和兩條3’race PCR引物：

5’race cDNA文庫及3’race cDNA文庫為廣東海洋大學惠贈，race PCR主要操作按照試劑盒說明書。瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并對目的DNA利用膠回收試劑盒回收純化，連接至pMD18載體，挑取陽性克隆送生物公司測序鑒定。

1.4 LvCDO的生物信息學預(yù)測

1.4.1 基本理化性質(zhì)預(yù)測

通過race實驗獲得LvCDO的cDNA的全長序列，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。利用DNAstar軟件對其ORF、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點等基本理化性質(zhì)進行分析[11]。

1.4.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將LvCDO的氨基酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，利用網(wǎng)站工具軟件BLAST程序進行同源性比對分析，進而利用MEGA 4.0進行多序列對比并利用鄰接歸并法（即N-J法）進行進化樹構(gòu)建[12]。供試物種為凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei、致乏庫蚊Culex quinquefasciatus XP_001870330、深裂眶鋸雀Stegastes partitus XP_008292285、青鳉Oryzias latipes XP_004072247、爪蟾Xenopus laevis NP_001083506、赤擬谷盜Tribolium castaneum XP_008195816、日本鰻Anguilla japonica BAL22276、智人Homo sapiens CAA80552、家鼠Mus musculus NP_149026、黃牛Bos taurus NP_001029637、太平洋牡蠣Crassostrea gigas EKC28611、非洲象 Loxodonta africana XP_003404533、家貓Felis catus XP_003980715、原雞Gallus gallus XP_424964和黑腹果蠅 Drosophila melanogaster AFH08164。

1.5 表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-LvCDO的構(gòu)建及其表達

接著利用EcoR I、Not I切割此片段及pGEX-4T-1空載體個1μg，37℃酶切2h。之后電泳膠回收相應(yīng)的核酸片段，并利用T4 DNA連接酶將其在16℃連接過夜并轉(zhuǎn)化、挑取陽性克隆送生物公司測序鑒定。

經(jīng)測序鑒定序列正確的克隆進行培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 （DE3）， 再挑取菌落進行菌落PCR鑒定。選取陽性克隆先少量培養(yǎng)，然后按照1：100的比例轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，待菌液呈輕搖有云霧狀，加入IPTG （0.04mmol/L） 37℃誘導表達3 h。10000g 5 min離心收取菌體，加入含有PMSF的冷PBS重懸菌體4℃條件下進行超聲波破碎10 min。接著4℃條件下10000g 離心15 min，收取上清。利用GST瓊脂糖凝膠對上清中的GST-LvCDO蛋白進行吸附，利用含有10mM 還原型谷胱甘肽的洗脫液體洗脫目的蛋白，制備蛋白電泳樣品進行蛋白電泳鑒定。

1.6 熒光定量PCR檢測LvCDO的轉(zhuǎn)錄

于凡納濱對蝦養(yǎng)殖基地分別設(shè)置鹽度約3‰ （當?shù)卣ｐB(yǎng)殖水體鹽度）和15‰的養(yǎng)殖水體中飼養(yǎng)兩組凡納濱對蝦，每組對蝦各150條。在不同時間點兩組對蝦分別取血淋巴和肝胰腺樣品；每個時間點樣品分3個平行，每個平行含5條蝦的相應(yīng)組織，故一個時間點共取對蝦15條對蝦的血淋巴和肝胰腺樣品。之后提取樣品RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行熒光定量PCR檢測LvCDO的轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR引物為：

2 結(jié)果分析

2.1 凡納濱對蝦LvCDO全長cDNA的獲取

通過5’ race PCR，獲得片段504 bp（圖1A）；通過3’ race PCR，獲得片段181bp（圖1B）。與之前EST序列進行拼接，獲得含poly（A）尾的LvCDO全長cDNA全長803 bp，含一個長609 bp的ORF，序列獲取號KP325604。此ORF編碼蛋白含202個氨基酸殘基，命名為LvCDO。LvCDO分子23kDa，等電點pI6.08，含有一個經(jīng)預(yù)測具有參與氧化還原過程功能的DUF1637結(jié)構(gòu)域（圖2）。同時利用SWISS-MODEL對LvCDO進行三維結(jié)構(gòu)建模（圖3）[13]。

2.2 CDO系統(tǒng)進化樹分析

將蛋白質(zhì)序列在NCBI上進行BLAST，獲得13個其他物種的CDO蛋白序列，這些物種也即是本研究的供試物種。利用MEGA 4.0建立的系統(tǒng)進化樹如圖5所示，可以看出供試的14個物種的CDO被聚成3大類。凡納濱對蝦和太平洋牡蠣的CDO歸為一類；赤擬谷盜、黑腹果蠅和致乏庫蚊的CDO歸為一類，而其他所試物種的CDO物種歸一類（圖5）。從蛋白序列的多序列對比看LvCDO與其他物種有較高的同源性（圖4）；從進化地位上看，凡納濱對蝦與同為海洋無脊椎動物的太平洋牡蠣的CDO比較接近（圖5）。這提示凡納濱對蝦CDO的功能應(yīng)該與太平洋牡蠣的CDO相近。

2.3 重組質(zhì)粒的表達和純化

通過蛋白電泳檢測，可見誘導表達的菌體在約45 kDa處有一明顯的蛋白條帶（圖6）， 分子量大小與預(yù)測相符。pET32a-LvCDO質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中表達的融合蛋白帶有6×His標簽，可利用GST瓊脂糖進行純化，從蛋白電泳檢測結(jié)果看到洗脫液蛋白樣品中具有一條45 kDa大小的條帶（圖6），與受誘導表達的目的蛋白相符，故判斷所純化到的蛋白即為融合表達的LvCDO， 且其至少部分為可溶性表達。

2.4 不同鹽度條件下凡納濱對蝦中LvCDO的轉(zhuǎn)錄水平變化

凡納濱對蝦是一種廣鹽性對蝦，可以在不同的鹽度條件下生存，然而較高鹽度的水體養(yǎng)殖的對蝦相較與在低鹽度水體中養(yǎng)殖的對蝦有更好的口感，據(jù)推測這可能與不同鹽度下游離氨基酸的數(shù)量和種類的不同有關(guān)，?；撬岬暮扛叩鸵彩窃蛑?。而作為牛磺酸生物合成的關(guān)鍵酶，CDO在面臨滲透壓脅迫時會做出響應(yīng)，調(diào)整牛磺酸的生成速度[14]。因養(yǎng)殖水體鹽度的變化而對表達量做出調(diào)整是CDO抗?jié)B透壓脅迫功能的一個體現(xiàn)。我們對LvCDO在不同鹽度條件下的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測分析。可以看到與在當?shù)卣｛}度的養(yǎng)殖水體中培養(yǎng)的凡納濱對蝦相比，在較高鹽度養(yǎng)殖水體（鹽度15‰）的凡納濱對蝦的血淋巴細胞和肝胰腺細胞中的LvCDO的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（圖7）。

3 結(jié)語

利用NCBI上獲得已知的LvCDO的EST序列，采用race PCR獲得其兩端未知序列，從而獲得含有完整的LvCDO ORF基因序列，并對其所編碼的蛋白質(zhì)序列的理化特征進行了分析；同時也進行了蛋白質(zhì)多序列對比和進化樹分析。將其ORF序列構(gòu)建原核表達載體，進行表達純化，獲得了較純的GST-LvCDO融合蛋白。同時熒光定量PCR分析表明，LvCDO可在轉(zhuǎn)錄水平對滲透壓脅迫做出響應(yīng)，調(diào)節(jié)凡納濱對蝦牛磺酸的合成。這些研究為深入理解LvCDO的功能，揭開凡納濱對蝦?；撬岬纳锖铣蓹C制奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015-04-25

作者簡介：歐英杰（1982—），男（漢），廣東饒平人，工程師，本科，研究方向：食品生物技術(shù)。