摘要：以青錢柳葉為原料，采用石油醚脫脂，沸水浴提取，乙醇沉淀，經(jīng)過Sevage 法除蛋白，冷凍干燥得到青錢柳葉精制多糖，苯酚-硫酸法測(cè)定了總糖含量。采用清除DPPH 自由基、清除羥基自由基的體外抗氧化模型，并以抗壞血酸（VC）為陽性對(duì)照，研究了青錢柳葉精制多糖的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，通過多步提取得率為1.79%，苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為84.7%，青錢柳葉精制多糖具有較好的抗氧化活性，青錢柳葉多糖對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基均有明顯的清除作用，且最高清除率分別為89.3%、63.4 %，其濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：青錢柳 多糖 抗氧化

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）08-0000-00

青錢柳俗稱搖錢樹、山麻柳、青錢李、甜茶樹、一串錢、等，屬雙子葉植物胡桃科青錢柳屬，是我國(guó)特有的單屬種，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，屬三類保護(hù)植物。青錢柳是一種高大速生闊葉喬木，因其樹形似柳，果實(shí)圓形似銅線，色青而下垂，故名“青錢柳”[1]。

青錢柳在民間的應(yīng)用，主要是制成保健茶飲用，具有悠久的應(yīng)用歷史，因其具有特殊的保健功能而被譽(yù)為“神茶”，是我國(guó)第一個(gè)獲得美國(guó)FDA 認(rèn)可的保健茶[2]。現(xiàn)代化學(xué)研究表明青錢柳的主要成分包括有機(jī)酸、黃酮、多糖和三萜類等，其中達(dá)瑪烷型三萜皂苷類是其主要的甜味成分[3]。藥理活性研究表明具有降糖[4]、降脂[5]、降壓[6]、抗腫瘤、抗菌[7]、抗氧化[8]和增強(qiáng)免疫[9]等多種作用，并安全無毒。

目前青錢柳的開發(fā)利用比較單一，主要是開發(fā)為保健茶產(chǎn)品，隨著青錢柳組培及擴(kuò)繁技術(shù)的推廣，大量的青錢柳葉資源亟待開發(fā)利用，本研究對(duì)青錢柳葉多糖進(jìn)行提取，然后測(cè)定其抗氧化性，為其綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥青錢柳葉，由陜西百圣生物工程有限公司從秦嶺南麓采集烘干保存。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；無水乙醇、濃硫酸、水楊酸、苯酚、正丁醇、氯仿、葡萄糖、乙醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、真空恒溫干燥箱（天京市拓普儀器有限公司）、冷凍干燥機(jī)LGJ-10D（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）、紫外分光光度計(jì)4802S（龍尼柯上海儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV10基本型（德國(guó)IKA公司）、722G可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1青錢柳多糖的制備

干燥的青錢柳葉粉碎，過40目篩。石油醚脫脂，按固液比1：10的比例進(jìn)行青錢柳粉石油醚（沸程60-90℃）回流1h脫脂，脫脂后過濾，濾渣烘干稱重。濾渣用無離子水回流提取多糖，固液比1：10，溫度95℃，提取2h，提取2次，過濾合并提取液，濾液減壓濃縮至原體積30%。加入3倍濃縮液體積的95%的乙醇，4℃醇沉過夜，反復(fù)醇沉4次，4500r/min，離心15min得到絮狀沉淀，得粗多糖。

將粗多糖復(fù)溶在蒸餾水，Sevage法脫蛋白[10]，Sevage試劑用氯仿和正丁醇體積比5：1配制，在粗多糖水溶液中按1/5體積加入Sevag試劑，混合物劇烈振搖30 min，靜置2h后，分液，重復(fù)操作5次，上層水液冷凍干燥得精制多糖樣品。

1.3.2青錢柳多糖的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸餾水準(zhǔn)確定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，搖勻后準(zhǔn)確吸取10mL該溶液，用蒸餾水稀釋定容至100mL，即得100 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精確配制90%，6%苯酚。

取9支干凈的具塞試管按表1方法操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞沸水放置20min，取出涼水冷卻10min，以0號(hào)作為空白調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)處（490nm）測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)（ug/mL），吸光度Y為縱坐標(biāo)，從而來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）多糖含量測(cè)定。將提取得到的青錢柳粗多糖用蒸餾水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測(cè)定方法，以樣液為參比液，測(cè)定溶液的吸光值，按回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液的多糖濃度。

1.3.3抗氧化活性測(cè)定

（1）DPPH·清除活性。將1mg/ml的樣品溶液用無水乙醇稀釋成質(zhì)量濃度為2，4，6，8和10mg/mL的溶液。分別取3mL上述溶液于試管中，加入2mL 0.2mmol/L的DPPH·溶液，混勻后避光靜置1h，在517 nm處測(cè)定吸光值（用原溶劑作參比）。同時(shí)測(cè)定3mL溶劑（無水乙醇）與2ml 0.2mmol/L的DPPH·溶液的混合溶液在517 nm處的吸光值。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，臨用前以去離子水配制成與待測(cè)物溶液同等濃度的對(duì)照液。蒸餾水做空白對(duì)照。做三次平行。按照下式計(jì)算不同濃度待測(cè)物的DPPH自由基清除率（IP）。

（2）·OH清除活性。將10mg/ml的待測(cè)物用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml 的待測(cè)物溶液，分別取1ml 上述待測(cè)物溶液于試管中，依次加入6mmol/l FeSO4 溶液1ml、6mmol/l水楊酸乙醇溶液1ml，最后加入8mmol/l的H2O2 溶液1mL以啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴加熱30min后終止反應(yīng)，于510nm測(cè)定吸光度。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，臨用前以去離子水配制成與本試驗(yàn)待測(cè)物溶液同等濃度的對(duì)照液。蒸餾水做空白對(duì)照。做三次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1多糖提取及含量測(cè)定結(jié)果

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，Y=0.0074x+0.0070，R2=0.9991，在0-80ug/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

經(jīng)過脫脂、水提、醇沉、脫蛋白，從20g青錢柳葉中得到0.358g精制多糖，提取得率為1.79%，苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為84.7%。

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 DPPH·清除作用

DPPH·具有單一的電子，所以能夠接受一個(gè)電子或氫離子，其乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517nm下具有最大吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子被配對(duì)從而吸收消失或減弱，顏色從紫色逐漸變成黃色，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析，間接評(píng)價(jià)該自由基清除劑的活性?？寡趸芰τ们宄时硎?，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。體外測(cè)定的青錢柳多糖對(duì)DPPH·清除效果見圖2，可看出青錢柳多糖的清除DPPH自由基的活性總體上小于陽性對(duì)照VC，但是其清除DPPH自由基的活性隨樣品濃度增加而增大，當(dāng)青錢柳濃度從2mg/mL增加到4mg/mL時(shí)，其清除DPPH自由基的能力迅速增加，達(dá)到76%，當(dāng)青錢柳濃度為10mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率為89.3%，基本上與VC清除率持平（90.9%）。

2.3.2·OH清除作用

和其他自由基相比，羥基自由基是體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，產(chǎn)生于生命活動(dòng)的氧化代謝過程，可使氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪類和核酸等大分子發(fā)生氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使轉(zhuǎn)化細(xì)胞脫離正常細(xì)胞的控制無限生長(zhǎng)而癌變[11]。

由圖3可以看出，青錢柳多糖對(duì)羥基有一定的清除活性，最高清除率是63.4%，葛霞等[8]對(duì)青錢柳的抗氧化活性研究的結(jié)果為當(dāng)多糖質(zhì)量濃度上升到1.2 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基清除率達(dá)到68.1%，與本研究的結(jié)果相符。維生素C 濃度在0.6-1.0mg/mL時(shí)，清除活性均在90%以上，由此看出青錢柳多糖的清除羥基自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陽性對(duì)照維生素C。對(duì)羥基自由基而講，目前普遍有兩個(gè)機(jī)理：一個(gè)是抑制羥基自由基的產(chǎn)生，另一是清除羥基自由。具體哪種機(jī)理需要被深入研究。

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明，青錢柳葉水提多糖具有一定的抗氧化能力，對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基有較好的清除作用，且濃度與清除率在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。雖然青錢柳粗多糖清除DPPH和自由基效果較陽性對(duì)照VC弱，但青錢柳多糖能夠達(dá)到清除自由基、阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用，在一定濃度范圍內(nèi)能抑制自由基引起的氧化損傷，這為青錢柳多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]上官新晨，陳木森，蔣艷 等.微波提取青錢柳多糖的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（5）：6-9.

[2]王克全，曹瑩.青錢柳化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)學(xué)， 2007，31（8）：577-679.

[3]何春年，彭勇，肖偉.青錢柳神茶的應(yīng)用歷史與研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14（5）：62-68.

[4]吳凡，王晨，嚴(yán)七秀 等.青錢柳降血糖功能因子研究概況[J].光明中醫(yī)，2014，29（10）：2245-2247.

[5]Kurihara H， Fukami H， Kusumoto A， et al. Hypoglycemic action of Cyclocary apaliurus （Batal.） Iljinskaja in normal and diabetic mice[J].Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 2003， 67（4）：877-880.

[6]侯小利，劉曉霞，王碩 等.青錢柳葉總黃酮對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2014，30（2）：62-69.

[7]黃貝貝，葉荷平.青錢柳抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18（4）：48-49.

[8]葛霞，陳婷婷，蔡教英 等.青錢柳多糖抗氧化活性的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（5）：59-64.

[9]黃貝貝，肖鳳儀，張文平 等.青錢柳對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，16（5）：59-60.

[10]史德芳，楊洋，孫曉雪 等.仙人掌多糖提取過程中三種脫蛋白方法的比較研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006（4）：93-95.

[11]王瑞遵.黃芪多糖的分離純化及體外抗氧化活性研究[D].河南：鄭州大學(xué)，2010.

收稿日期：2015-03-26

作者簡(jiǎn)介：胡紅忠（1969—），男，陜西略陽縣人，工程師，從事保健食品及食品開發(fā)與加工20余年。