摘要：本文旨在建立一種制備19-去甲睪酮完全抗原及單克隆抗體的方法。通過丁二酸酐將19-去甲睪酮（19 β NT）半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)得到偶聯(lián)物（19 β NT-HAS-BSA），以此進(jìn)行免疫、篩選，最終獲得3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞（4D5，6F2，7E7），并制得相應(yīng)的單克隆抗體。用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，對(duì)7E7株抗體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)：抗體的親和常數(shù)為3.35×108 L/mol，半抑制濃度為0.35 ng/mL，表明此抗體對(duì)19-去甲睪酮有很強(qiáng)的親和力；以19-去甲睪酮為參照物，抗體對(duì)丙酸諾龍的交叉反應(yīng)率為80.3%，對(duì)甲基睪酮、睪酮、群勃龍、己烯雌酚等的交叉反應(yīng)率均小于0.2%，表明此抗體具有良好的特異性。由此可知，7E7株抗體可用于對(duì)19-去甲睪酮、丙酸諾龍的免疫分析。

關(guān)鍵詞：19-去甲睪酮 單克隆抗體 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法 交叉反應(yīng)率

中圖分類號(hào)：R446 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）08-0000-00

19-去甲睪酮（19-nortestosterone，NT），簡(jiǎn)稱諾龍，分子量為274.4，是一種合成激素，具有雄激素樣作用的同化激素，有很強(qiáng)的促蛋白合成能力，參與生長(zhǎng)發(fā)育的生理調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨骼和肌肉的生長(zhǎng)，被非法用于動(dòng)物飼料添加劑。本文采用與免疫原不同偶聯(lián)臂的篩選原篩選抗19-去甲睪酮單克隆雜交瘤細(xì)胞株，制備高親和力抗19-去甲睪酮單克隆抗體，為研制高靈敏度的檢測(cè)19-去甲睪酮免疫方法提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑

19-去甲睪酮、甲基睪酮、睪酮、丙酸諾龍、群勃龍、己烯雌酚、鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇，德國(guó)Dr公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，生工生物工程；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG1500，sigma；RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基，Gibco；SP2/0公司保種；胎牛血清（FBS），杭州四季青生物工程公司；羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP）、過氧化脲、TMB、降脂烷，sigma產(chǎn)品，其它試劑均為分析純。

1.2主要設(shè)備

SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HF151UV CO2培養(yǎng)箱，Heal Force；TS100電子顯微鏡，Nikon；TDL-40B 上海安亭科學(xué)儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器，BOXUN；BSA224S-CW電子天平，Sartorius；酶標(biāo)儀MULTISKAN MK3，Thermo；明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)，Millipore；精密酸度計(jì)ORION 3 STAR，Thermo；分光光度計(jì)（北京普析）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡Balb/C雌性小鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4方法

1.4.1完全抗原制備

（1）免疫原制備。采用丁二酸酐，EDC法合成免疫原，用TLC點(diǎn)板跟蹤。

（2）篩選原制備。采用戊二酸酐，EDC法合成篩選原，用TLC點(diǎn)板跟蹤。

1.4.2蛋白含量的測(cè)定

按照BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒使用說明書，對(duì)蛋白進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

1.4.3動(dòng)物免疫

6～8周齡Balb/C雌性小鼠，取一定量的抗原與等量的弗氏佐劑乳化，25ug/只，分多點(diǎn)皮下注射。第一次用弗氏完全佐劑，以后用不完全佐劑，共免疫5次，融合前三天不加佐劑20ug/只，腹腔注射。

1.4.4抗血清效價(jià)及抑制率的測(cè)定

（1）酶標(biāo)板準(zhǔn)備。用碳酸緩沖液（PH9.6）將篩選原稀釋成0.1ug/ml，100ul/孔，4度過夜；第二天用3%脫脂奶粉120ul/孔封閉，37度，60分鐘孵育，洗板4次。

（2）抗血清效價(jià)測(cè)定。用PBST將血清稀釋不同的倍數(shù)，每孔加入50ulPBS，加入50ul稀釋好的抗血清，37度，30分鐘孵育，洗板4次；加入稀釋好的酶標(biāo)二抗100ul/孔；37度，30分鐘孵育，洗板4次；加入顯色劑100ul/孔，37度15分鐘孵育；加入終止液50ul/孔；在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)。

（3）血清抑制率測(cè)定。每孔加入50ul，用PBS稀釋成不同濃度的NT，加入50ul稀釋好的抗血清，37度，30分鐘孵育，洗板4次；加入稀釋好的酶標(biāo)二抗100ul/孔；37度，30分鐘孵育，洗板4次；加入顯色劑100ul/孔，37度15分鐘孵育；加入終止液50ul/孔；在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)。

1.4.5細(xì)胞融合

融合半個(gè)月前復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，用1×8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)。融合前3天對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊免疫，融合前1天做飼養(yǎng)細(xì)胞用HAT培養(yǎng)。融合時(shí)，脫頸致死小鼠，無菌取脾制備脾細(xì)胞在PEG-1500作用下與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合（細(xì)胞數(shù)量比約為5：1），融合后的細(xì)胞懸液加入到一鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，HAT培養(yǎng)。

1.4.6雜交瘤細(xì)胞篩選

融合后12天進(jìn)行換全液，14～15天用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（icELISA）篩選強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、生長(zhǎng)狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞株，并進(jìn)行3次亞克隆。將篩選的雜交瘤細(xì)胞株由96孔板轉(zhuǎn)到24孔板，再到125ml的細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)量足夠多時(shí)，收集細(xì)胞，用含10%DMSO的培養(yǎng)基在液氮中保存（凍存過程為4度放置30分鐘，-20度放置30分鐘，干冰中過夜，然后轉(zhuǎn)到液氮罐中）。

1.4.7單克隆抗體的生產(chǎn)

雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大生長(zhǎng)后收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106個(gè)/ml，然后向10天前注射過降脂烷的小鼠腹腔注射0.5ml/只。待小鼠腹部明顯脹大，精神狀態(tài)不佳時(shí)，抽取腹水，飽和硫酸銨法純化19-去甲睪酮單克隆抗體。.

1.4.8單克隆抗體免疫性質(zhì)鑒定

（1）BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定單克隆抗體蛋白含量；方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度和單克隆抗體稀釋度；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定靈敏度；交叉反應(yīng)率CR測(cè)定特異性。CR=（NT的IC50/類似物或常見藥物的I50）×100，R越低、抗體特異性越強(qiáng)。

（2）單抗對(duì)19-去甲睪酮的親和常數(shù)試驗(yàn)：以1μg/mL NT-OVA包被，間接ELISA法測(cè)定不同濃度的抗NT單克隆抗體與包被抗原反應(yīng)的A450nm值，以單克隆抗體濃度為橫坐標(biāo)，以A450nm值為縱坐標(biāo)繪制反應(yīng)曲線，并在曲線上找到趨于平坦段A值的50%所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)Ka。

2結(jié)果

2.1人工完全抗原的鑒定

19-去甲睪酮分子量為274.4，屬小分子化合物，只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)抗體。本試驗(yàn)采用丁二酸酐，EDC法與BSA偶聯(lián)形成免疫抗原；采用戊二酸酐，EDC法與OVA偶聯(lián)形成包被原。為證明免疫抗原與包被抗原偶聯(lián)反應(yīng)是否成功，本試驗(yàn)用以下方法對(duì)人工完全抗原進(jìn)行鑒定。

2.1.1紫外掃描

具有共軛系統(tǒng)的物質(zhì)，由于分子組成與空間構(gòu)型不同，具有特征性的紫外光譜，因此可以通過紫外光譜定性鑒定抗原是否偶聯(lián)成功。根據(jù)掃描結(jié)果可知偶聯(lián)物的吸收峰發(fā)生明顯偏移，表明小分子與載體蛋白成功偶聯(lián)。

2.1.2完全抗原蛋白濃度的測(cè)定

利用BCA試劑盒測(cè)定人工抗原的蛋白質(zhì)含量。按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到免疫原NT-BSA蛋白質(zhì)的濃度是8.29mg/mL，包被抗原NT-OVA中蛋白質(zhì)的濃度是10.9mg/mL。

2.2動(dòng)物免疫血清檢測(cè)

2.2.1 動(dòng)物免疫血清效價(jià)檢測(cè)

以HRP為二抗，TMB為顯色體系，采用間接ELISA法測(cè)定四只小鼠的血清效價(jià)。從圖1可以看出，4只小鼠血清效價(jià)都達(dá)到了320000左右。

2.2.2 免疫血清抑制率測(cè)定

將系列濃度的19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液與4只小鼠血清進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，以NT濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以B/B0×100%為縱坐標(biāo)。結(jié)果見圖2。從圖2可以看出1號(hào)小鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線y=24.90-46.99x，R2=0.985，IC50=0.292μg/mL；2號(hào)小鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線y=33.16-55.19x，R2=0.997，IC50=0.495μg/mL；3號(hào)小鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線y=32.87-47.96x，R2=0.919，IC50=0.439μg/mL；4號(hào)小鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線y=31.29-45.69x，R2=0.998，IC50=0.389μg/mL。1號(hào)小鼠IC50明顯小于其他3個(gè)小鼠，故將其進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3細(xì)胞融合篩選

細(xì)胞融合后兩周，用間接ELISA法檢測(cè)8塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，共獲得10個(gè)陽(yáng)性孔，由于這10個(gè)陽(yáng)性孔中有4個(gè)孔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，去除這4個(gè)孔，最終得到6個(gè)陽(yáng)性孔，將這6株細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，最后用間接ELISA法測(cè)定單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清的親和性，其中有3個(gè)單克隆孔的上清效價(jià)高，親和性好，分別命名為4D5，6F2，7E7。綜合比較間接ELISA的結(jié)果及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，最后選擇7E7編號(hào)的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)大，制備腹水，其余的凍存?zhèn)浞荨?/p>

2.4單克隆抗體免疫性質(zhì)鑒定

2.4.1 單克隆抗體蛋白濃度測(cè)定

經(jīng)過包和硫酸銨法純化的單克隆抗體，利用BCA試劑盒測(cè)定人工抗原的蛋白質(zhì)含量。按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到單克隆抗體蛋白濃度為5.45mg/mL。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立抗19-去甲睪酮單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度和單克隆抗體稀釋度，用0.01mol，PH=7.4的PBS稀釋19-去甲睪酮，建立了抗19-去甲睪酮單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，半抑制濃度（IC50）為0.35ng/mL。

2.4.3單抗對(duì)19-去甲睪酮的親和能力測(cè)定

以1μg/mL NT-OVA包被，idELISA法測(cè)定單克隆抗體的親和力，取趨于平坦段A450nm值為2.22的50%所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)（Ka），所獲單克隆抗體的Ka為3.35×108L/mol。

2.4.4特異性試驗(yàn)

選擇結(jié)構(gòu)相似的藥物以及己烯雌酚、鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇分別與NT單克隆抗體對(duì)結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。對(duì)丙酸諾龍交叉反應(yīng)率達(dá)80.25%，對(duì)甲基睪酮、睪酮、群勃龍、己烯雌酚、鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇均小于0.2%，顯示良好的特異性。

3 分析與討論

半抗原，抗原與抗體之間是通過氫鍵、疏水基團(tuán)，靜電作用等共同決定的。不同長(zhǎng)度的碳鏈能夠避開橋抗干擾作用，改變包被原與檢測(cè)物直接的競(jìng)爭(zhēng)性平衡關(guān)系，從而提高抗體檢測(cè)的靈敏度和減少類似物的交叉反應(yīng)率。本實(shí)驗(yàn)利用丁二酸酐作為免疫原的連接臂，通過多次小劑量免疫小鼠與及采用比免疫原長(zhǎng)一個(gè)碳鏈的戊二酸酐作為包被抗原的連接臂，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.35ng/ml，實(shí)現(xiàn)了提高靈敏度的目的，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

收稿日期：2015-03-10

作者簡(jiǎn)介：謝冬霞（1982—），女，漢族，廣東梅州人，本科，總經(jīng)理，中級(jí)職稱，研究方向：食品安全檢測(cè)技術(shù)。