摘要：本實(shí)驗(yàn)采用短程精餾法分離純化大豆油脫臭餾出物中的生育酚。利用褶皺假絲酵母脂肪酶將甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸甾醇酯，?；视娃D(zhuǎn)化為游離脂肪酸，游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯。采用兩階段原位酶促反應(yīng)消除甲醇抑制甾醇類物質(zhì)酯化。最終結(jié)果：生育酚純化度76.4%。

關(guān)鍵詞：褶皺假絲酵母脂肪酶 酯化 短程精餾 原位酶促反應(yīng) 大豆油脫臭餾出物

中圖分類號：O643 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）08-0000-00

作為天然抗氧化劑，生育酚備受關(guān)注。植物油脫臭餾出物是植物油精煉過程中的副產(chǎn)品，其中富含生育酚。目前生育酚提取純化采用傳統(tǒng)工業(yè)法，化學(xué)甲基化、分子蒸餾、溶劑分餾和離子交換層析結(jié)合的方式。為了實(shí)現(xiàn)對更高純度產(chǎn)品的追求，工藝過程的研究尤為重要。但是游離脂肪酸、生育酚沸點(diǎn)的相近性導(dǎo)致無法有效分餾。本實(shí)驗(yàn)嘗試研究游離脂肪酸甲酯化、脂肪酸甾醇化與酰基甘油水解同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油脫臭餾出物（哈爾濱天通農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供）；褶皺假絲酵母脂肪酶，購于日本愛知Meito Sangyo有限公司；分析純0.5% 三氟化硼、分析純5.9%甲醇鈉、分析純甲醇購于日本和光純化化學(xué)工業(yè)有限公司；己酸甘油酯購于東京Kasei Kogyo有限公司；其它化學(xué)藥品均屬國產(chǎn)分析級。

1.2 儀器與設(shè)備

PL-203型電子天平：梅特勒-托利多公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IV型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TY-100分子蒸餾設(shè)備：北京澤龍?zhí)煊羁萍加邢薰?；HZS-HA型恒溫水浴振蕩器：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所； HP5890氣相色譜儀：美國安捷倫公司；CA-07水分測定儀：日本東京三菱化工。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶反應(yīng)

預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，由于酶對底物中甾醇和游離脂肪酸高度專一性，對酯化產(chǎn)物、脂肪酸甾醇酯的消極反應(yīng)，導(dǎo)致酯化反應(yīng)結(jié)果不明顯。當(dāng)大豆油脫臭餾出物濃縮液中含水量調(diào)整為20%時(shí)，可以適度提高反應(yīng)混合物的流動(dòng)性。

試驗(yàn)在50mL頂部留有氮?dú)饪诘娜萜髦羞M(jìn)行。在30℃的條件下對大豆油脫臭餾出物濃縮液（含水、褶皺假絲酵母脂肪酶）進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)伴隨以500r/min的速度進(jìn)行混合。在分別培養(yǎng)5、16、24h后將甲醇注入到混合物中。

通過脂肪酶處理回收獲得的油層，在80℃，5mmHg的條件下脫水60min。利用蒸餾器使脫水后的油層在160℃，0.2mmHg的條件下蒸餾。利用分子蒸餾設(shè)備去除蒸餾物中的脂肪酸甲酯。為分離殘?jiān)兄舅徵薮减?，之前反?yīng)殘?jiān)?40℃，0.02mmHg的條件下進(jìn)行二次蒸餾。二次蒸餾后，將含有生育酚、甾醇和游離脂肪酸的蒸餾產(chǎn)物放入一個(gè)1L的反應(yīng)器中，同時(shí)加入含水量20%的褶皺假絲酵母脂肪酶混合液（200U/g），與脂肪酶第一次處理相同的條件下攪拌。經(jīng)過16h培養(yǎng)，加入2mol甲醇/1mol游離脂肪酸的游離脂肪酸，反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行6-10h。第二次脂肪酶處理后的油層脫水后采用階梯式蒸餾方式：第一階段溫度、壓力條件，160℃，0.2mmHg；第二階段溫度、壓力條件，175℃，0.2mmHg；第三階段溫度和壓力條件，240℃，0.02mmHg。

1.3.2 分析方法

每組反應(yīng)混合物樣品加熱至90℃，直至分層?；厥沼蛯舆M(jìn)行分析。利用氣相色譜儀確定甾醇、生育酚、部分?；视秃椭舅徵薮减サ暮?。利用己酸甘油酯作為內(nèi)標(biāo)，通過氣相色譜儀確定脂肪酸甲酯的含量。從含有0.5%三氟化硼的3ml甲醇中提取0.1g樣品，75℃保持5min，以完成大豆油脫臭餾出物濃縮液中脂肪酸化學(xué)性甲基化。利用含0.1- 1.0mol/L氫氧化鉀的游離脂肪酸滴定的方式測定大豆油脫臭餾出物濃縮液的酸價(jià)和其它樣品。通過大豆游離脂肪酸（KOH 198.8mg /g）的酸價(jià)為基準(zhǔn)確定脂肪酸的含量。脫水后油層中的水分含量通過費(fèi)歇爾滴定法確定7。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醇添加對酯化的影響

脂肪酶處理大豆油脫臭餾出物濃縮液過程中甲醇的影響。含有4g大豆油脫臭餾出物濃縮液，1g水，酶活力100 U/g的褶皺假絲酵母脂肪酶混合液的混合液體，加入2mol甲醇/1mol游離脂肪酸的游離脂肪酸，在30℃的溫度條件下攪拌。

結(jié)果顯示，醇基酯化的抑制作用可以通過添加甲醇（恒溫保存16h）的方法消除。因此，我們設(shè)計(jì)在甾醇向脂肪酸甾醇酯轉(zhuǎn)化的反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后再向反應(yīng)混合物中添加甲醇。

2.2 甲醇用量梯度變化對酯化的影響

酶和甲醇的用量影響著大豆油脫臭餾出物濃縮液的原位反應(yīng)的兩個(gè)階段。按原位反應(yīng)兩個(gè)階段要求，16h恒溫?cái)嚢韬蠹尤氩煌康鸟薨櫦俳z酵母脂肪酶。然后向混合物中加入不等量的甲醇，恒溫培養(yǎng)24h。結(jié)果表明，甲醇用量階梯式遞增可以有效抑制甲醇導(dǎo)致的脂肪酶失活，強(qiáng)化游離脂肪酸向脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化。

2.3 褶皺假絲酵母脂肪酶對兩階段原位反應(yīng)的影響

在單一反應(yīng)條件下，甾醇向脂肪酸甾醇酯的轉(zhuǎn)化反應(yīng)不會(huì)超過80%。為了進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)化率，我們進(jìn)而嘗試重復(fù)處理脂肪酶。添加甲醇后，脂肪酸甾醇酯含量發(fā)生降低。

2.4 酶處理、分子蒸餾對生育酚純度的影響

利用重復(fù)的兩階段原位反應(yīng)與分子蒸餾的結(jié)合純化生育酚的純化。為進(jìn)一步降低甾醇、生育酚含量，反應(yīng)產(chǎn)物（脂肪酸甾醇酯、脂肪酸甲酯）利用短程精餾的方式去除。

2.5 兩階段原位反應(yīng)對純化的影響

褶皺假絲酵母脂肪酶參與反應(yīng)時(shí)，游離脂肪酸、甾醇和甲醇的反應(yīng)。在游離脂肪酸、甾醇和甲醇的混合物中，脂肪酶識別游離脂肪酸的能力強(qiáng)于甾醇，并且對脂肪酸甲酯和脂肪酸甾醇酯的作用較弱。進(jìn)而，脂肪酸甲酯合成先于脂肪酸甾醇酯。

3 結(jié)語

含有褶皺假絲酵母脂肪酶的大豆油脫臭餾出物濃縮液的兩階段原位反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了酰基甘油的水解，脂肪酸甾醇酯化和游離脂肪酸的甲酯化。酶反應(yīng)與短程精餾的結(jié)合增加了生育酚的含量（17.2%增至76.4%，回收率89.6%）。

收稿時(shí)間：2015-06-17

作者簡介：曲彤旭（1979—），男，漢族，黑龍江哈爾濱人，博士在讀，畢業(yè)于哈爾濱商業(yè)大學(xué)，就職于黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，研究方向：糧油加工。