摘要：采用復(fù)合酶水解脫脂蠶蛹蛋白制備復(fù)合氨基酸，為提高蠶蛹蛋白的水解度，使用Design-Expert軟件中的Central Composite Design響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對復(fù)合蛋白酶的組成進(jìn)行優(yōu)化，建立響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。結(jié)果表明：水解脫脂蠶蛹蛋白的復(fù)合酶的最佳組成是堿性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%、風(fēng)味蛋白酶19.51%。使用此復(fù)合酶配方對脫脂蠶蛹蛋白進(jìn)行水解，脫脂蠶蛹蛋白的水解度可以達(dá)到38.7%。

關(guān)鍵詞：脫脂蠶蛹蛋白 復(fù)合酶 響應(yīng)面

中圖分類號：Q814.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）08-0000-00

我國是家蠶的原產(chǎn)地，是世界上最主要的蠶絲生產(chǎn)國，蠶蛹是蠶絲工業(yè)的主要副產(chǎn)品，在我國產(chǎn)量巨大。蠶蛹具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，蠶蛹中蛋白質(zhì)的含量約占60%左右[1]。脫脂蠶蛹蛋白富含人體所需的18種氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)價(jià)值。利用脫脂蠶蛹蛋白水解制取的復(fù)合氨基酸具有提高免疫力、改善心血管功能、預(yù)防心腦血管疾病、補(bǔ)充平衡營養(yǎng)、提高機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能的功效，已被廣泛開發(fā)成各種類型的營養(yǎng)保健產(chǎn)品[2]。目前，水解脫脂蠶蛹蛋白的方法有酸法、堿法和酶法三種，其中酶法水解具有反應(yīng)條件溫和、不破壞氨基酸、不產(chǎn)生消旋作用、綠色環(huán)保等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用。但是酶法最關(guān)鍵的技術(shù)問題就是如何提高脫脂蠶蛹蛋白的水解度（DH），提高游離氨基酸的含量。本試驗(yàn)采用復(fù)合酶水解制備復(fù)合氨基酸，使用Design-Expert軟件中的Central Composite Design響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對復(fù)合蛋白酶的組成進(jìn)行優(yōu)化，以提高脫脂蠶蛹蛋白的水解度。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

脫脂蠶蛹蛋白購自南通福爾生物制品有限公司，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶購自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合酶水解脫脂蠶蛹蛋白

準(zhǔn)確稱取50g脫脂蠶蛹蛋白置于1000mL燒杯中，加入純水定容至500ml，攪拌均勻，水浴加熱至90℃維持10min使蛋白質(zhì)變性，然后冷卻至55℃并維持，加入5%的復(fù)合蛋白酶自然pH值酶解10小時(shí)。

1.2.2 水解度的測定方法

蛋白水解度（DH）是指蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)之比[3]。蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂后α-氨基氮含量增加，因此可以根據(jù)水解過程中生成的α-氨基氮的含量來計(jì)算DH。使用甲醛滴定法測定水解后α-氨基氮的量，使用凱氏定氮法測定樣品的總氮量[4]，計(jì)算DH的公式如下：

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

使用中心組合Central Composite Design （CCD）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[5]，對復(fù)合蛋白酶組成中的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的配比進(jìn)行優(yōu)化。以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶在復(fù)合酶組成中的百分比為考察因素，分別以A、B、C表示，則C=100%-A-B，因此以A和B為因素水平、DH為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化。采用Design-Expert（Version 8.05b）軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

設(shè)定堿性蛋白酶A、中性蛋白酶B的因素水平見表1所示，采用CCD響應(yīng)面設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)安排與結(jié)果如表2所示。

2.2 回歸方程與方差分析

由表3 回歸模型的方差分析中可以看出，通過Design-Expert軟件計(jì)算得到的多元回歸方程模型p值=0.0343顯著，而失擬項(xiàng)p值=0.9035不顯著，說明模型的擬合度較好，能夠反映試驗(yàn)的具體水平結(jié)果。

2.3 響應(yīng)因子水平優(yōu)化

使用Design-Expert軟件做出回歸模型響應(yīng)值與因素水平間的響應(yīng)曲面和等高線圖，見圖1。

從圖1中可以看出，各因素水平對響應(yīng)值的影響變化趨勢及因素水平之間交互作用。從圖中可以看出，兩個(gè)因素水平的響應(yīng)值對應(yīng)的曲面和等高線具有最優(yōu)的響應(yīng)區(qū)域。使用Design-Expert軟件進(jìn)行嶺脊分析及回歸方程計(jì)算，可以得到最優(yōu)的響應(yīng)值相對應(yīng)的因素水平為：堿性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，計(jì)算出風(fēng)味蛋白酶為19.51%。使用該最優(yōu)的復(fù)合酶配方，DH的最大預(yù)測值為38.4%。以此試驗(yàn)得到的最優(yōu)配方進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的DH平均值為38.7%，與預(yù)測值吻合度較高，說明該響應(yīng)面模型能夠較好的反映實(shí)際試驗(yàn)情況，并能準(zhǔn)確預(yù)測正常的試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)語

以中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法（CCD）對水解脫脂蠶蛹蛋白的復(fù)合酶配方進(jìn)行優(yōu)化，使用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，建立響應(yīng)面回歸方程并進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明模型的擬合度較好，能夠較好的預(yù)測試驗(yàn)水平。利用該響應(yīng)面模型預(yù)測最優(yōu)復(fù)合酶配方為：堿性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，風(fēng)味蛋白酶為19.51%。使用最優(yōu)配方進(jìn)行三批驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的DH平均值為38.7%，與模型預(yù)測值極為接近。使用優(yōu)化后的復(fù)合酶配方水解脫脂蠶蛹蛋白，可以得到更高的蛋白水解度。試驗(yàn)證明，使用中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對水解脫脂蠶蛹蛋白的復(fù)合酶配方進(jìn)行優(yōu)化是行之有效的。

參考文獻(xiàn)

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[4]大連輕工業(yè)學(xué)院，華南理工大學(xué).食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994，141-160.

[5]陳斌，莊英萍，郭美錦，等.中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化梅嶺霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].高技術(shù)通訊，2002，12（12）：29-33.

收稿日期：2015-04-20

第一作者簡介：周旭波（1981—），男，山東威海人，碩士，工程師，主要研究方向：食品生物技術(shù)。