摘要：以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）HX2105為生產(chǎn)菌株，研究了不同碳源，不同初糖濃度以及不同的補(bǔ)糖策略對(duì)L-絲氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果表明以蔗糖為碳源對(duì)HXV2105發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的效果最好，在100g/L的初糖濃度下，L-絲氨酸發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了13.05 g/L。通過連續(xù)流加補(bǔ)糖策略，使蔗糖濃度在15～25g/L之間維持相對(duì)穩(wěn)定，10L罐發(fā)酵96h L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到了25.55g/L。

關(guān)鍵詞：L-絲氨酸 碳源 發(fā)酵 補(bǔ)糖策略

中圖分類號(hào)：TS2；Q815 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）08-0000-00

絲氨酸，又名蠶絲氨酸，最初由蠶絲蛋白水解分離所得，雖然屬于非必需氨基酸，但作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見氨基酸之一，絲氨酸具有許多重要的生理功能和作用，在飼料、農(nóng)業(yè)、食品、藥品、化妝品工業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用。目前生產(chǎn)絲氨酸的方法主要有，化學(xué)合成法、水解提取法、酶法、添加前體物發(fā)酵法、糖質(zhì)原料直接發(fā)酵法。絲氨酸發(fā)酵法的研究報(bào)告主要集中在添加前體物發(fā)酵法上，甘油酸鹽（或酯）、甘油酸三甲內(nèi)鹽、甘氨酸被認(rèn)為是發(fā)酵合成絲氨酸最有前景的前體物[1]。左愛蓮等[2]利用甘氨酸為前體物的發(fā)酵，絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到了7.5g/L，但作為前體物的甘氨酸價(jià)格昂貴，通過添加甘氨酸等前體發(fā)酵法生產(chǎn)絲氨酸不能滿足快速增長的市場(chǎng)需求。而直接發(fā)酵法利用糖質(zhì)原料為碳源，不僅原料供應(yīng)充足，而且價(jià)格相對(duì)低廉，是L-絲氨酸生產(chǎn)的重要方向。研究以糖質(zhì)為碳源對(duì)L-絲氨酸發(fā)酵的影響，對(duì)于提高絲氨酸產(chǎn)量，降低低絲氨酸生產(chǎn)成本，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

1材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）HX2105為廣東環(huán)西生物科技股份有限公司技術(shù)中心菌種室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖30.0，磷酸二氫鉀1.5，七水硫酸鎂0.6，硫酸錳0.02，玉米漿干粉4.0，酵母粉3.0，VH 0.00015，VB1 0.00045，pH7.0～7.2；121℃滅菌20分鐘。

1.2.1 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）

磷酸二氫鉀2.5，七水硫酸鎂0.8，VH0.00015，VB1 0.00040，硫酸錳0.03，硫酸亞鐵0.5，硫酸銨25.0，玉米漿干粉2.5，pH7.0～7.2；121℃滅菌20分鐘。

1.3 分析檢測(cè)

1.3.1 絲氨酸含量的測(cè)定：采用高效液相色譜儀測(cè)定[3]

1.3.2 菌體生物量（以菌體干重DCW表示）的測(cè)定[3]

發(fā)酵液用0.25mol/L鹽酸稀釋50倍，562nm測(cè)光密度，按1OD=0.27g/L DCW換算為菌體干重。

1.3.3 發(fā)酵液中蔗糖的測(cè)定：間苯二酚法測(cè)定[4]

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)絲氨酸發(fā)酵的影響

以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，研究不同糖質(zhì)原料碳源對(duì)菌株HX2105生長和L-絲氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，如圖1所示。從圖中可以看出，以麥芽糖，乳糖，可溶性淀粉等糖質(zhì)原料為碳源時(shí)，菌體生長很弱，L-Ser產(chǎn)量也很小。而以葡萄糖為碳源時(shí)，雖然菌體生長較前麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉等糖質(zhì)碳源好，但L-Ser產(chǎn)量沒有明顯增加。而以果糖和蔗糖為碳源時(shí)菌體生長和L-Ser產(chǎn)量都有顯著增加，其中以蔗糖為碳源時(shí)效果最好，菌體生物量和產(chǎn)酸分別達(dá)到了10.9g/L，13.8g/L，與文獻(xiàn)[5，6]以蔗糖為最優(yōu)碳源的研究結(jié)果是一致的。

2.2 初糖濃度對(duì)絲氨酸發(fā)酵的影響

合適的初糖濃度不僅能為菌體生長提供充足的碳源與合成產(chǎn)物所需的碳骨架[7]，還能調(diào)節(jié)發(fā)酵液的粘度，維持參透壓，有利于菌體生長，不同初始蔗糖濃度對(duì)于L-Ser發(fā)酵的影響結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，菌體的生物量和L-Ser產(chǎn)量都逐步提高，初糖濃度達(dá)到100g/L時(shí)生物量和產(chǎn)酸達(dá)到了最大值，分別為10.13g/L，13.05g/L。隨著初糖濃度的進(jìn)一步增加，菌體生物量和L-Ser逐漸下降，最適初糖濃度為100g/L。

2.3 糖濃度的控制與補(bǔ)糖策略研究

2.3.1 糖濃度的控制

發(fā)酵進(jìn)入到菌體轉(zhuǎn)化期和絲氨酸積累期以后，合適的糖濃度對(duì)于進(jìn)一步維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外的快速物質(zhì)交換有重要作用，有利于產(chǎn)物的快速生成與積累。實(shí)驗(yàn)研究了從5～40g/L的糖濃度下，菌體生物量和L-絲氨酸產(chǎn)量的變化情況，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，糖濃度在15～25g/L時(shí)菌體生物量與L-絲氨酸的產(chǎn)量最大。濃度過低，合成L-絲氨酸碳骨架的流量減少，從而影響絲氨酸的積累。糖濃度過高，則影響發(fā)酵液的滲透壓，從而影響產(chǎn)物的合成與釋放。所以在L-絲氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期，蔗糖濃度在15～25g/L之間為宜。

2.3.2 補(bǔ)糖策略的研究

隨著發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期和產(chǎn)物的快速生成，糖的消耗加快，為了使產(chǎn)酸期的殘?zhí)菨舛饶芸刂圃?5～25g/L間，以維持菌體生長和促進(jìn)產(chǎn)物生成，需要向發(fā)酵液補(bǔ)加蔗糖。三種不同補(bǔ)糖模式和策略對(duì)L-絲氨酸發(fā)酵的影響如圖3、4、5所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次性補(bǔ)糖模式（圖3），補(bǔ)糖后糖濃度急劇升高，菌體生長受到抑制，產(chǎn)酸明顯變慢，使發(fā)酵周期延長，此種補(bǔ)糖策略不利于提高產(chǎn)酸。分批補(bǔ)糖模式（圖4）對(duì)于菌體生長的抑制不顯著，但糖濃度波動(dòng)幅度較大，受糖濃度大幅波動(dòng)影響，產(chǎn)酸變慢，終產(chǎn)量較低，對(duì)生產(chǎn)不利。最好的補(bǔ)糖模式是通過連續(xù)流的策略使蔗糖濃度維持相對(duì)穩(wěn)定（圖5），降低糖濃度波動(dòng)帶來的不利影響，此種模式下，菌體生物量和L-絲氨酸產(chǎn)量分別為14.82g/L，25.55g/L，達(dá)到最大值。

3結(jié)語

在多種碳源中，對(duì)L-絲氨酸發(fā)酵最好的碳源是蔗糖，最合適的初糖濃度是100g/L，通過流加的方式補(bǔ)加一定量的蔗糖，使糖濃度維持在15～25g/L時(shí)，對(duì)于L-絲氨酸發(fā)酵最有利，在此模式下，菌體生物量和產(chǎn)酸達(dá)到最大值，分別為14.82g/L，25.55 g/L。

參考文獻(xiàn)

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[3]林琳.利用糖質(zhì)原料產(chǎn)L-絲氨酸菌株SYPS-062的代謝機(jī)制初探[D].江南大學(xué)，2008.

[4]劉萬紅，劉愛福，李文鑫等.絲氨酸羥甲轉(zhuǎn)移酶基因的功能表達(dá)及其活性鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，28（1）：5-8.

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[7]浦軍平，莊國英，顧岳良，陳剛. 低糖流加法生產(chǎn)L-纈氨酸發(fā)酵工藝條件的研究[J]. 氨基酸和生物資源，2003，04：48-51.

收稿日期：2015-04-25

作者簡(jiǎn)介：陳偉波（1982—）男（漢族），廣東普寧人，本科學(xué)士，助理工程師，主要從事氨基酸發(fā)酵行業(yè)工作和食品生物技術(shù)方向研究。