摘要：牛磺酸（Taurine）是一種具有多種生物活性的含硫非蛋白氨基酸，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、眼睛發(fā)育、滲透壓調(diào)節(jié)等方面有重要功能，目前在飼料、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)有重要應(yīng)用。同時其也是魚類等水產(chǎn)動物風(fēng)味形成的呈味氨基酸。半胱次磺酸脫羧酶（cysteine sulfinate decarboxylase， CSD）是牛磺酸生物合成的限速酶，在?；撬岬暮铣芍杏兄匾δ?。本研究利用race PCR技術(shù)克隆到了凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的半胱次磺酸脫羧酶基因（L. vannamei CSD， LvCSD）的全長序列，對其編碼的蛋白的特性進(jìn)行了分析。同時構(gòu)建原核表達(dá)載體對其進(jìn)行表達(dá)，獲得可溶表達(dá)的LvCSD，并利用鎳柱對其進(jìn)行純化，獲得較純的重組LvCSD。另外還發(fā)現(xiàn)LvCSD在較鹽度為15‰的養(yǎng)殖水體中的凡納濱對蝦的血淋巴細(xì)胞和肝胰腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平較高。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦 牛磺酸 半胱次磺酸脫羧酶 克隆 表達(dá)

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）06-0000-00

Abstract： Taurine is a nonprotein amino acid that has a great variety of biological activity， such as nervous system development， eyes development， osmotic regulation and other aspects. And it with important applications in the feed industry， drink industry as well as pharmaceutical industry so far. At the same time， it also the delicious amino acid of fish and other aquatic animal. And Cysteine sulfinate decarboxylase is a rate limiting enzyme in the biosynthesis of taurine. In this study， race PCR technology has been used to clone the full-length of cysteine sulfinate decarboxylase of Litopenaeus vanname （LvCSD）. And the characteristics of LvCSD were analyzed. At the same time， prokaryotic expression vector was constructed for expression of LvCSD， and then soluble LvCSD was purified by nickel column. It also found that the expression of LvCSD at a salinity of 15‰ was upregulated in haemocytes and hepatopancreas of L. vanname.

Key words： Litopenaeus vanname；taurine； cysteine sulfinate decarboxylase；clone；expression

?；撬幔═aurine），又稱為牛膽酸，是一種非蛋白氨基酸，無遺傳密碼子，不組成蛋白質(zhì)和酶類，具有廣泛的生物學(xué)功能 [1-3]。因其具有緩解疲勞和提神的作用，為一些抗疲勞飲料和保健口服液中的成份。

水產(chǎn)動物具有較高含量的?；撬醄4]?，F(xiàn)有的研究表明水產(chǎn)動物牛磺酸的來源有兩種，靠自身合成或直接從餌料中攝取[5-6]。不同種類的水產(chǎn)動物對?；撬嵝枨罅看嬖诓町惻c其內(nèi)源合成牛磺酸能力有關(guān)，但是也受養(yǎng)殖動物的發(fā)育階段、環(huán)境鹽度以及食性的影響[6-7]。而對于?；撬岬纳锖铣啥园腚状位撬崦擊让?（cysteine sulfinate decarboxylase， CSD）是其關(guān)鍵酶[8-10]。凡納濱對蝦是目前國內(nèi)供應(yīng)量最大的蝦類，其含有較大量的?；撬?。牛磺酸除了參與凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的生命活動過程[11]，對于形成凡納濱對蝦獨(dú)特的風(fēng)味口感和營養(yǎng)價值的形成也有貢獻(xiàn)。然而目前關(guān)于凡納濱對蝦的?；撬嵘锖铣傻臋C(jī)制仍不甚明了。為了研究凡納濱對蝦?；撬岷铣傻臋C(jī)制，作者克隆了凡納濱對蝦?；撬岷铣傻年P(guān)鍵酶半胱次磺酸脫羧酶（L. vannamei cysteine CSD， LvCSD）。作者通過對LvCSD基因開展相關(guān)的分子生物學(xué)研究，為進(jìn)一步理解凡納濱對蝦牛磺酸生物合成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli DH5，基因型supE44 lacU169 80 lacZ M15 hsdR recA1 endAgurA1 thi-1 relA1；大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3），基因型F-，ompT，hsdS（rBB-mB-），gal，dcm（DE3）為廣東省食品工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pMD19-T為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pET32a+為廣東海洋大學(xué)惠贈。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

主要試劑SMART? RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒、T4 DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、SYBR? Green Master Mix： SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNase H Plus）、SYBR PrimeScript? RT-PCR試劑盒（Perfect Real Time）、T4 DNA Ligase均為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶 BamH I、Xho I為FERMENTERS公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為OMEAG公司產(chǎn)品；預(yù)裝鎳柱子為QIAGEN產(chǎn)品；預(yù)染蛋白Marker為Bio-Rad公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；DNA marker （DL2000）為東勝生物公司產(chǎn)品，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器

主要儀器設(shè)備LightCycler480熒光定量PCR儀：購自德國Roche公司；PCR儀為東勝生物公司制造；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；E412951型凝膠成像儀、EPS-300A型數(shù)顯雙穩(wěn)電泳儀，上海天能科技有限公司制造；離心機(jī)由德國Eppendorf公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)由美國GE公司生產(chǎn)；SW-CJ-1F超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；THZ-C型恒溫?fù)u床由廣州深華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 LvCSD的擴(kuò)增

根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的有關(guān)LvCSD的表達(dá)序列標(biāo)簽序列（expressed sequence tag， EST）FE130135.1和FE130136.1，設(shè)計(jì)兩條5’race PCR引物和兩條3’race PCR引物：

5’race PCR引物1：GAGGTATGTACCAGAAACATGTATTGGT

5’race PCR引物2：TAACACGTCTGAATCCTGGACGCACTCC

3’race PCR引物1：TGGATTTTGTACTAGATGAAATCGAAAG

3’race PCR引物2：GGTAAAGACTTGTAGAGTACTTCAAAGTTTGC

5’race cDNA文庫及3’race cDNA文庫為廣東海洋大學(xué)惠贈，race PCR主要操作按照試劑盒說明書。瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并對目的DNA利用膠回收試劑盒回收純化，連接至pMD19載體，挑取陽性克隆送生物公司測序鑒定。

1.4 LvCSD的生物信息學(xué)預(yù)測

1.4.1 基本理化性質(zhì)預(yù)測

通過race實(shí)驗(yàn)獲得LvCSD的cDNA的全長序列，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列獲取號KP325603。利用DNAstar軟件對其開放閱讀框、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析[12]。

1.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將LvCSD的氨基酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，利用網(wǎng)站工具軟件BLAST程序進(jìn)行同源性比對分析，進(jìn)而利用MEGA 4.0進(jìn)行多序列對比并利用鄰接歸并法（即N-J法）進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建[13]。供試物種為印度跳蟻Harpegnathos saltator EFN89907、亞洲水牛 Bubalus bubalis XP_006046688、斑馬魚 Danio rerio XP_009295318、家貓 Felis catus XP_006933792、大蜜蜂 Apis dorsata XP_006608196、短尾負(fù)鼠 Monodelphis domestica XP_001363928.1、原雞 Gallus gallus XP_423847、長牡蠣 Crassostrea gigas EKC37548、揚(yáng)子鱷 Alligator sinensis XP_006030664、矛尾魚 Latimeria chalumnae XP_005986193、山羊 Capra hircus XP_005679979；羅非魚 Oreochromis niloticus XP_005472409、抹香鯨 Physeter catodon XP_007125840、大熊貓 Ailuropoda melanoleuca XP_002923320和凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei。

1.5 表達(dá)質(zhì)粒pET32a-LvCSD的構(gòu)建及其表達(dá)

利用pET32a-LvCSD-BamH I-F和pET32a-LvCSD-Xho I-R擴(kuò)增帶限制性酶BamH I、Xho I識別位點(diǎn)的LvCSD開放閱讀框序列，引物序列如下：

pET32a-LvCSD-BamH I -F： TATggatccATGAGCGCTTCAGCTGAAAAC

pET32a-LvCSD-Xho I-R： TTActcgagATGAGCGCTTCAGCTGAAAAC

接著利用BamH I、Xho I切割此片段及pET32a+空載體個1μg，37℃酶切2 h。之后電泳膠回收相應(yīng)的核酸片段，并利用T4 DNA連接酶將其在16℃連接過夜并轉(zhuǎn)化、挑取陽性克隆送生物公司測序鑒定。

經(jīng)測序鑒定序列正確的克隆進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）， 再挑取菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。選取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并加入IPTG（0.05mmol/L） 22℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。10000g 5 min離心收取菌體，加入含有PMSF的冷PBS重懸菌體4℃條件下進(jìn)行超聲波破碎10 min。接著4℃條件下10000g 離心15 min，收取上清。利用預(yù)裝鎳柱對上清中的LvCSD-His融合蛋白進(jìn)行吸附，利用含有200 mM 咪唑的洗脫液體洗脫目的蛋白，制備蛋白電泳樣品進(jìn)行蛋白電泳鑒定。

1.6熒光定量PCR檢測LvCSD的轉(zhuǎn)錄

于凡納濱對蝦養(yǎng)殖基地設(shè)置兩組在不同鹽度（正常組鹽度約3‰及人工加入海水晶至鹽度15‰的高鹽組）下飼養(yǎng)的凡納濱對蝦，每組對蝦各150條。在不同時間點(diǎn)兩組對蝦分別取血淋巴和肝胰腺樣品；每個時間點(diǎn)樣品分3個平行，每個平行含5條蝦的相應(yīng)組織，故一個時間點(diǎn)共取對蝦15條對蝦的血淋巴和肝胰腺樣品。之后提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測LvCSD的轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR引物為：

QPCR-LvCSD-F： TTGCTGACGTGTGCCAAGA

QPCR-LvCSD-R： TCCCCAGCAGGCATCAA

2 結(jié)果分析

2.1 凡納濱對蝦LvCSD全長cDNA的獲取

通過5’ race PCR，獲得片段1201bp；通過3’ race PCR，獲得片段273bp（圖1）。與之前EST序列進(jìn)行拼接，獲得含poly （A）尾的LvCSD全長cDNA全長1892bp，含一個長1491 bp的ORF。此ORF編碼蛋白含497個氨基酸殘基，命名為LvCSD。LvCSD分子55.8 kDa，等電點(diǎn)pI6.03，含有一個經(jīng)預(yù)測具有羧酶活性的pyridoxal_deC （Pfam數(shù)據(jù)庫： PF00282） 結(jié)構(gòu)域（圖2）。同時利用SWISS-MODEL對LvCSD進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模（圖3）[14]。

2.2 CSD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將蛋白質(zhì)序列在NCBI上進(jìn)行BLAST，獲得13個其他物種的CSD蛋白序列，這些物種也即是本研究的供試物種。利用MEGA 4.0建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示，可以看出供試的14個物種的CSD被聚成3大類。印度跳蟻和大蜜蜂的CSD歸為一類，凡納濱對蝦的CSD單獨(dú)列為一類，而其他所試物種的CSD物種歸一類。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，雖然在蛋白的序列上LvCSD與其他物種有較高的同源性（圖4），但在進(jìn)化上其地位比較特殊，LvCSD與其他物種，包括其他無脊椎動物的CSD均不是很接近。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)和純化

通過蛋白電泳檢測，可見誘導(dǎo)表達(dá)的菌體在約75 kDa處有一明顯的蛋白條帶（圖6A）， 分子量大小與預(yù)測相符。pET32a-LvCSD質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)的融合蛋白帶有6×His標(biāo)簽，可利用鎳柱進(jìn)行純化，從蛋白電泳檢測結(jié)果看到洗脫液蛋白樣品中有一條75 kDa大小的條帶（圖6B），與受誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白相符，故判斷所純化到的蛋白即為融合表達(dá)的LvCSD， 且其為可溶性表達(dá)。

圖6 LvCSD的表達(dá)純化（A）泳道M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；泳道1是空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌裂解液中的蛋白；泳道2是轉(zhuǎn)化了pET32a-LvCSD的大腸桿菌裂解液中的蛋白。（B）泳道M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；泳道1是經(jīng)鎳柱純化后得到的6×His-LvCSD融合蛋白。

Fig. 6 Expression and purification of the recombination LvCSD （A） Line M protein marker，line 1 E. coli transforming with empty vector，line 2 E. coli transforming with pET32a-LvCSD， both IPTG induced； （B） Line M protein marker， line 1 6×His-LvCSD purified with Ni-NTA.

2.4 不同鹽度條件下凡納濱對蝦中LvCSD的轉(zhuǎn)錄水平變化

在水生動物中，?；撬嵩跈C(jī)體抗?jié)B透壓脅迫方面有重要功能[15-16]；而作為一種食物，牛磺酸則在凡納濱對蝦風(fēng)味的形成中有作用[17]。凡納濱對蝦是一種廣鹽性對蝦，可以在不同的鹽度條件下生存，然而較高鹽度的水體養(yǎng)殖的對蝦相較與在低鹽度水體中養(yǎng)殖的對蝦有更好的口感，據(jù)推測這可能與不同鹽度下游離氨基酸，包括牛磺酸的含量高低的表達(dá)有關(guān)。而CSD是牛磺酸生物合成的關(guān)鍵酶，因此我們對LvCSD在不同鹽度條件下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測分析?？梢钥吹脚c在3‰左右的養(yǎng)殖水體中培養(yǎng)的凡納濱對蝦相比，在較高鹽度養(yǎng)殖水體（鹽度15‰）的凡納濱對蝦的肝胰腺組織和血淋巴細(xì)胞中的LvCSD的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（圖7）。

3 結(jié)語

根據(jù)NCBI上有關(guān)LvCSD的EST序列，擴(kuò)增到其兩端序列，獲得完整的LvCSD基因序列，并對其蛋白質(zhì)序列特征進(jìn)行了分析。同時根據(jù)其完整的ORF信息構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得可溶性表達(dá)，并進(jìn)行了純化，獲得了較純的LvCSD融合蛋白。另，熒光定量PCR分析表明，LvCSD在較高鹽度養(yǎng)殖水體中培養(yǎng)的凡納濱對蝦的體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于在較低鹽度水體中養(yǎng)殖的凡納濱對蝦。這些研究為LvCSD的功能，乃至凡納濱對蝦牛磺酸的生物合成機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015-03-25

作者簡介：歐英杰（1982—），男（漢），廣東饒平人，工程師，本科，研究方向：食品生物技術(shù)。