摘要：應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了養(yǎng)殖用水中氯霉素殘留量的定量分析方法。在水樣中加入內(nèi)標(biāo)，經(jīng)乙酸乙酯提取，以5 mmol/L乙酸銨和甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)C18色譜柱分離，采用串聯(lián)質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行定性定量分析，內(nèi)標(biāo)法定量。氯霉素在0.5～20 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好線性，相關(guān)系數(shù)為0.9994，檢出限和定量限分別為0.002 μg/L和0.005 μg/L。在0.02、0.05、0.20 μg/L三個(gè)濃度水平范圍的平均回收率為88.0%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%～8.4%。本方法的靈敏度較高，且簡(jiǎn)單、快速，可以滿足養(yǎng)殖用水中氯霉素殘留檢測(cè)的需要。

關(guān)鍵詞：氯霉素 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS） 養(yǎng)殖用水 內(nèi)標(biāo)法

中圖分類號(hào)：S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）06-0000-00

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一種有效的廣譜抗菌素，曾廣泛的應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖。但是氯霉素能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血，白血病、過敏性變態(tài)反應(yīng)等嚴(yán)重疾病，低濃度的藥物殘留還會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性[1-3]。因此，氯霉素在許多國(guó)家被禁止在食品性動(dòng)物中使用。我國(guó)在農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則》（NY5071-2002）和《無公害食品 畜禽飼養(yǎng)獸藥使用準(zhǔn)則》（NY 5030-2006）[4-5]中也已將氯霉素列為禁用藥物。但是由于氯霉素具有價(jià)廉、高效、用量少的特點(diǎn)，氯霉素仍然存在非法使用和誤用的可能。因此有必要建立養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中氯霉素的有效檢測(cè)方法，嚴(yán)控違禁藥物的使用，確保養(yǎng)殖生產(chǎn)過程的無害化。

目前氯霉素的檢測(cè)方法主要集中在動(dòng)物源性食品的檢測(cè)[6-8]，因?yàn)樗w和養(yǎng)殖產(chǎn)品的樣品性質(zhì)、制備以及取樣量存在較大差異，所需檢測(cè)方法也有所不同。本研究建立了養(yǎng)殖用水中氯霉素的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法具有快速高效、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于養(yǎng)殖用水中的氯霉素殘留監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司，1200系列），三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司，6410系列），漩渦振蕩器（德國(guó)IKA公司，MS2系列），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司，RV 10 Basic V系列），純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司，Milli-Q系列）。甲醇（HPLC級(jí)）、乙腈（HPLC級(jí)），購(gòu)于Honeywell公司；氯化鈉、乙酸銨均為AR級(jí)，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。標(biāo)準(zhǔn)品氯霉素（CAP）、氘代氯霉素（CAP-d5），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

準(zhǔn)確稱取0.0500 g氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于-20 ℃下保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)需要配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下保存，當(dāng)天使用。準(zhǔn)確稱取0.0500 g氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于-20 ℃下保存。用甲醇稀釋至10 mg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)工作液使用。

1.3 儀器工作參數(shù)

（1）色譜條件；Agilent Eclipse C18液相色譜柱（4.6× 50mm，3.5 μm）。流動(dòng)相：5 mmol/L 乙酸銨：甲醇（4+6）。流速：0.5 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL。（2）質(zhì)譜條件；電噴霧負(fù)電離源（ESI-）；離子霧化源溫度350℃；氣流速10L/min；霧化器壓力40 psi；噴霧電壓4000V；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitor，MRM）。優(yōu)化后的檢測(cè)條件見表1。

1.4 測(cè)定步驟

（1）樣品保存與處理；水樣經(jīng)砂芯漏斗過濾除去固體懸浮物，于冰箱4℃下貯存?zhèn)溆?。?）提取；量取100.0mL水樣，置于250 mL分液漏斗中，加入50μL標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)工作液。加入5g氯化鈉，振搖；再加入30mL乙酸乙酯，振搖1 min，靜置分層，取上層乙酸乙酯于100 mL梨形瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃水浴下減壓濃縮至近干，加入1.0 mL5%甲醇水溶液，渦旋30s，過0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)氯霉素的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，選擇ESI為離子源。因?yàn)槁让顾鼐哂休^強(qiáng)的電負(fù)性，適合使用ESI負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)。使用流動(dòng)注射進(jìn)樣方式對(duì)氯霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)物CAP-d5的母離子進(jìn)行掃描，得到其準(zhǔn)分子離子峰為321.1和326.2，以適當(dāng)?shù)呐鲎材芰繉?duì)準(zhǔn)分子離子峰掃描，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的子離子作為定量離子，選擇響應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)的子離子作為定性離子。選擇MRM掃描模式對(duì)母離子與子離子進(jìn)行裂解電壓和碰撞能量的優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了乙腈和甲醇作為有機(jī)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用甲醇比使用乙腈的基線穩(wěn)定。因?yàn)槁让顾卦谪?fù)離子模式下檢測(cè)，因此LC-MS/MS常用的甲酸并不適合添加，而實(shí)驗(yàn)中加入適量的乙酸銨可以促進(jìn)電離和改善峰形。最終實(shí)驗(yàn)選擇甲醇和5 mmol/L乙酸銨混合溶液作為流動(dòng)相。氯霉素與氯霉素-d5在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)下的特征離子圖質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖1 5.0 μg/L氯霉素與氯霉素-d5在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)下的特征離子圖質(zhì)量色譜圖

2.3 方法的線性關(guān)系與檢出限

養(yǎng)殖水中溶解的有機(jī)質(zhì)可能導(dǎo)致LC-MS/MS信號(hào)的增強(qiáng)或者減弱，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，選擇在水樣中添加氯霉素的同位素化合物CAP-d5作為內(nèi)標(biāo)物，有效的避免了不同水體中的基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。配制0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入氯霉素-d5內(nèi)標(biāo)工作液，使每毫升標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中含有混合氘代同位素內(nèi)標(biāo)5.0 ng。按上述條件進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，得到氯霉素的線性方程為y=1135.96x+307.47，相關(guān)系數(shù)R2為09994。氯霉素在0.5～20.0 μg/L濃度范圍具有良好線性關(guān)系，見圖2所示。在空白水樣中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍和10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度算得方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.002 μg/L和0.005 μg/L。

圖2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 回收率與精密度

在不含氯霉素的水樣中，分別添加0.02、0.05和0.20 μg/L濃度水平的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述實(shí)驗(yàn)方法，每一添加水平平行測(cè)定5次，測(cè)得0.02～0.20 μg/L添加水平范圍的加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。

3 結(jié)語

本研究建立了養(yǎng)殖用水中氯霉素的LC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)方法，該方法具有快速簡(jiǎn)單、檢出限低、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，適合于養(yǎng)殖用水中氯霉素殘留量的快速準(zhǔn)確分析。

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收稿日期：2015-03-09

基金項(xiàng)目：廣東省科技廳省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B040400002）

作者簡(jiǎn)介：許均圖（1989—），男，廣東茂名，本科，畢業(yè)于中山大學(xué)，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)方法研究。E-mail：582625732@qq.com