摘要：為了從梔子果實(shí)中分離純化得到了品質(zhì)較高的梔子黃色素，創(chuàng)新的采用了循環(huán)水提取與大孔樹脂分離純化相結(jié)合的方法。通過靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)篩選樹脂，并利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，HPD-100A 樹脂對梔子黃色素選擇性高，適宜純化梔子黃色素。循環(huán)水提取梔子黃的較佳實(shí)驗(yàn)條件為：提取溫度60oC，提取時(shí)間4.5 h，循環(huán)流速12 mL/min，此條件下，梔子黃色素提取率達(dá)到2.14%，梔子黃產(chǎn)品OD小于0.35，色價(jià)大于420。該方法工藝簡單，成本低，梔子黃提取率較高，為梔子黃色素的工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：梔子果實(shí) 梔子黃色素 循環(huán)水提取 分離純化

中圖分類號(hào)：T S202. 3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）06-0000-00

1 引言

梔子黃色素是一種水溶性的類胡蘿卜素，有較高的營養(yǎng)價(jià)值，極易被人體吸收，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成維生素A，補(bǔ)充人體維生素[1]。研究表明，梔子黃色素還有抗癌和抗氧化的特性[2]。因此，梔子黃色素在食品、藥品等行業(yè)有廣泛應(yīng)用，是一種著色力強(qiáng)、安全性好并具有營養(yǎng)保健作用的天然植物色素。

梔子果實(shí)中有效成分的提取方法有溶劑浸提法[3，4]、滲漉法[5]、超聲提取法[6]、微波提取法[7]等。其中乙醇浸提法較其他方法更適于工業(yè)生產(chǎn)，但是生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，而且乙醇成本較高。以水代替乙醇，可以節(jié)省成本，但提取率偏低，且提取液中雜質(zhì)含量高，純化困難。本文采用循環(huán)水提取與大孔樹脂分離純化相結(jié)合的方法，得到純度較高的梔子黃。此方法成本較低，工藝簡單，為梔子黃色素工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

2 材料與方法

2.1材料與試劑

梔子果實(shí)，購于浙江省遂昌縣，于45 oC烘箱中烘干24 h，粉碎至約40目，避光陰涼處備用；西紅花苷I標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%），梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%），購于中國食品藥品鑒定研究院；大孔吸附樹脂：HPD-100、HPD-100A、AB-8、HPD-400、NKA、D101、X-5，均購于滄州寶恩化工有限公司。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 梔子黃色素和梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）梔子黃色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取西紅花苷I標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）5.25 mg，去離子水稀釋制備梯度溶液，高效液相色譜檢測峰面積。色譜條件：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6×150 mm）；流動(dòng)相：乙腈/水（20： 80， v/v， 0-5 min； 50：50， v/v， 5-25 min）；流速：1.0 mL/min；色譜柱柱溫：25 oC；檢測波長：440 nm；進(jìn)樣量：10 uL。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。梔子黃色素標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=3732.7x+2.283（R2=0.9995）。

（2）梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）9.33 mg，去離子水稀釋制備梯度溶液，高效液相色譜檢測峰面積。色譜條件：色譜柱：Edipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 oC；流動(dòng)相：乙腈-水（12：88）；波長：238nm；流速：6 mL/min；進(jìn)樣量：10 uL。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣液所含質(zhì)量（ug）為橫坐標(biāo)繪制梔子苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1454.0x-1.182（R2=1）。

2.2.2梔子黃色素提取液的制備

稱取40 g梔子果實(shí)粉碎物，以料液比1：20的比例加入水，在50 oC下機(jī)械攪拌提取2 h。抽濾得到梔子黃色素水提液備用。

2.2.3大孔吸附樹脂預(yù)處理

將七種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂（HPD-100、HPD-100A、HPD-400、D101、AB-8、NKA、X-5）置于無水乙醇中，浸泡24h，濾去乙醇并用水洗滌至無醇味，冷藏備用。

2.2.4靜態(tài)吸附和解吸附

分別稱取1.0 g處理過的HPD-100、HPD-100A、HPD-400、AB-8、D101、NKA、X-5樹脂，置于100 mL錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中加入100 mL梔子黃水提液。將七個(gè)錐形瓶用保鮮膜密封后放入恒穩(wěn)震蕩儀中，設(shè)定溫度20 oC，轉(zhuǎn)速150 rpm，震蕩24 h 后抽濾，檢測濾液中梔子黃色素和梔子苷的濃度，計(jì)算吸附率，公式如下：

式中：C0為提取液中有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為搖床震蕩后水溶液中有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL。

分別將錐形瓶中的大孔吸附樹脂取出，濾去提取液后加入100 mL 80%乙醇水溶液，用保鮮膜密封后放入恒穩(wěn)震蕩儀中，設(shè)定溫度為20 oC，轉(zhuǎn)速150 rpm，震蕩24 h 后抽濾，檢測濾液中梔子黃色素和梔子苷的濃度，計(jì)算解吸附率，公式如下：

式中：C1為搖床震蕩后水溶液中有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2 為80%乙醇水溶液中有效物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2.2.5工藝路線

圖表 1 實(shí)驗(yàn)裝置圖

如圖1所示，搭好實(shí)驗(yàn)裝置。稱適量梔子果實(shí)粉碎物到柱1中，柱2中裝入適量大孔吸附樹脂，錐形瓶中裝入適量水。開啟水浴加熱，待測溫處流出水溫達(dá)到要求值則開始循環(huán)。循環(huán)提取結(jié)束后，柱2用適量水和20%乙醇水溶液洗脫雜質(zhì)，再用適量80%乙醇水溶液洗脫梔子黃色素，經(jīng)濃縮干燥得梔子黃色素產(chǎn)品。取梔子黃產(chǎn)品，用蒸餾水溶解，高效液相檢測。產(chǎn)品參數(shù)計(jì)算如下：

式中C 為產(chǎn)品中梔子黃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)， g/g；m為產(chǎn)品質(zhì)量， g；M為原料質(zhì)量， g。

精密稱取0.100 g梔子黃色素產(chǎn)品，用蒸餾水定容。紫外分光光度計(jì)檢測在440 nm與238 nm處吸光度值。

式中，A440為梔子黃色素的吸光度；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

式中，A238為238 nm處的吸光度數(shù)值；A440為440 nm處的吸光度數(shù)值。

2.2.6響應(yīng)面分析

經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)探索，選取提取溫度、提取時(shí)間、循環(huán)水流速這三個(gè)因素，每個(gè)因素的低、中和高水平分別編碼為-1 、0和1， 以梔子黃色素的提取率為響應(yīng)值（Y）。利用Design-Expert 8.0.6軟件，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平（見表1）， 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （見表4）。

2.2.7 最佳水循環(huán)提取工藝條件的檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和回歸方程，預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最佳工藝條件， 以此條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值與理論值對比，檢驗(yàn)工藝可靠性。

3.結(jié)果與分析

3.1樹脂篩選結(jié)果

HPD-100、HPD-100A、HPD-400、AB-8、NKA、D101、X-5七種大孔吸附樹脂對梔子黃色素的吸附率及解吸率見表2和表3.

由表2 中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，七種大孔吸附樹脂對梔子黃色素的吸附率都較高，其中X-5的吸附率最大，但對梔子黃的選擇性較低。雖然HPD-100A對梔子黃色素的吸附率為93.94%，但對梔子苷的吸附率最小，對梔子黃色素具有最好的吸附選擇性。由表3數(shù)據(jù)可知，HPD-100A型樹脂梔子黃色素的解吸率較高，因此，選擇 HPD-100A型樹脂對梔子黃色素進(jìn)行分離純化。

3.2梔子黃提取工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化及分析

3.2.1響應(yīng)面分析模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件的ANOVA程序，對于表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

利用軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。模型P < 0.0001，表明該模型回歸方程極其顯著，不同的實(shí)驗(yàn)因子之間的差異高度顯著。R2=0.995表明模型回歸方程擬合程度良好，預(yù)測值與實(shí)際值之間具有高度的相關(guān)性。失擬項(xiàng)P=0.1657 > 0.05，不顯著，說明使用該方程模擬3因素3水平的分析可行。各實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系，其中A、B、C、A2、B2、C2對Y值得影響極顯著（P < 0.01）。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，影響梔子黃色素提取率的因素按主次順序排列為：C>B>A，其中循環(huán)流速對梔子黃色素提取率影響最大。

3.2.2響應(yīng)面及等高線分析

各因素對響應(yīng)值的影響直觀的反應(yīng)在響應(yīng)面圖上，而等高線的形狀可以反應(yīng)各因素交互作用的強(qiáng)弱，等高線趨近橢圓形，表示交互作用較強(qiáng)，而趨于圓形則表示交互作用較弱[9]。

圖2反應(yīng)了循環(huán)流速和提取溫度對梔子黃色素提取率的影響，等高線呈橢圓形，說明循環(huán)流速和提取溫度之間的交互作用顯著。當(dāng)溫度一定時(shí)，提取率隨著循環(huán)流速的增大而明顯升高，而后趨于穩(wěn)定；當(dāng)循環(huán)流速較低時(shí)，溫度對提取率隨的影響不大；當(dāng)循環(huán)流速較高時(shí)，提取率隨溫度的增大先上升后略呈下降趨勢。

圖表 2 流速和溫度對梔子黃提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖3反應(yīng)了循環(huán)流速和提取時(shí)間對梔子黃色素提取率的影響，等高線呈橢圓形，表明循環(huán)流速和提取溫度之間的交互作用顯著。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取率隨著循環(huán)流速的增大呈迅速升高后略微下降的趨勢。

圖表 3流速和時(shí)間對梔子黃提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

3.2.3最佳水循環(huán)提取工藝條件的檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和回歸方程，預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最佳工藝條件為：提取溫度62.76 oC，時(shí)間為4.67 h，循環(huán)流速為12.92 mL/min，在此條件下梔子黃色素提取率的理論值為2.19%。為了驗(yàn)證分析結(jié)果的可靠性，使用得到的最佳工藝條件進(jìn)行梔子黃色素的提取，考慮到實(shí)際操作的方便性，將提取條件修正為提取溫度60 oC，提取時(shí)間4.5 h，循環(huán)流速12 mL/min。

經(jīng)過三次平行實(shí)驗(yàn)得到梔子黃色素提取率的平均值為2.14%，與理論值2.19%相符合，RSD小于1%，因此可知該模型能夠較好的預(yù)測循環(huán)法提取梔子黃色素的提取率。

3.3 梔子黃色素產(chǎn)品的檢測結(jié)果.

在篩選得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6。梔子黃產(chǎn)品提取率大于2 %，OD值小于0.35，色價(jià)大于420。該工藝操作簡單，穩(wěn)定可行，成本低，且得到的梔子黃色素產(chǎn)品品質(zhì)較高，相對有機(jī)溶劑提取有較高的優(yōu)勢。

4 結(jié)語

本文采用循環(huán)水提取與大孔樹脂分離純化相結(jié)合的方法，得到了品質(zhì)較高的梔子黃色素。通過靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)，篩選得到對梔子黃色素選擇性高的HPD-100A 樹脂；通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到較佳實(shí)驗(yàn)條件：提取溫度60oC，提取時(shí)間4.5 h，循環(huán)流速12 mL/min，此條件下，梔子黃色素提取率達(dá)到2.14%，OD值小于0.35，色價(jià)大于420。此工藝操作簡便，成本低，且能有效地提取梔子黃色素，為梔子黃色素工業(yè)生產(chǎn)提供重要的參考價(jià)值。

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收稿日期：2015-03-20

項(xiàng)目資助：浙江省科技廳公益技術(shù)研究項(xiàng)目“基于機(jī)械化學(xué)反應(yīng)的植物有效成分選擇性提取關(guān)鍵技術(shù)研究”，項(xiàng)目編號(hào)：2013C32009

作者簡介：逯恒，（1991—），男，山東臨沂人，碩士研究生，從事機(jī)械化學(xué)方面的研究。

*通訊作者：馮雯，（1979—），女，浙江寧波人，醫(yī)學(xué)碩士，從事機(jī)械化學(xué)方面研究。