摘要：我國是維生素C生產大國，產能占全世界維生素C市場的90%，但隨著越來越多的維生素C生產項目上馬，市場爭奪日趨激烈，眾多科研機構也將維生素C項目作為研究熱點，積極研發(fā)新技術，開發(fā)降低企業(yè)生產成本、提高維生素C產率的新方法。

關鍵詞：生物合成 維生素C 產量

中圖分類號：R977.23 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）06-0000-00

我國作為維生素C的生產大國，其產能占世界維生素C市場的90%，如何進一步鞏固我國在維生素C這一國際市場中的優(yōu)勢地位，取得定價話語權是擺在維生素C生產企業(yè)面前的一個課題。在破解這個課題的過程中，不斷提高企業(yè)綜合競爭力，特別是掌握維生素C生產過程中出現(xiàn)的新技術新方法，掌握提高維生素C產量的關鍵方法是各個生產企業(yè)的重要任務。

1 菌種改造策略

中科院趙世剛等人運用低能N+離子注入技術對伴生菌巨大芽孢桿菌進行了改造和選育，離子注入后的巨大芽孢桿菌在發(fā)酵過程中分泌更多的堿性物質，有利于中和酮古龍酸桿菌產酸過程中逐漸積累的2-KGA，這種環(huán)境更有利于酮古龍酸桿菌的生長和產酸；隨著空間生物學的蓬勃興起和迅速發(fā)展，空間飛船搭載菌株已成為另一種重要的誘變技術。郭立格等人對“神舟四號”飛船搭載處理的一批產酸菌株進行了篩選，在418株酮古龍酸桿菌中共篩選出4株糖酸轉化率提高4%～5%的酮古龍酸桿菌，且部分菌株的發(fā)酵周期縮短了20h。清華大學蔡磊等人在酮古龍酸桿菌中過表達葉酸的基因簇，通過驗證酮古龍酸桿菌的生物量和糖酸轉化率分別提高了18%和14%，在混菌發(fā)酵過程中生物量和糖酸轉化率分別提高了25%和35%。江南大學陳堅教授課題組通過分別敲除控制伴生菌芽孢桿菌屬菌株（巨大芽孢桿菌）中控制產孢的spo0A和spoVFA的基因，改造后的菌株在與酮古龍酸桿菌的混菌發(fā)酵中糖酸轉化率比未改造前分別降低了33%和70%，酮古龍酸桿菌的菌數(shù)分別在兩種混菌搭配中相對應的減少了15%和49%，充分說明了伴生菌芽孢桿菌屬菌株的產孢過程對幫助酮古龍酸桿菌的生長和產酸有重要作用。由于巨大芽孢桿菌可以在33℃下生長，而酮古龍酸桿菌只能在30℃以下才能保持較好的生理學狀態(tài)，Yan Bing等人通過離子注入等方法對酮古龍酸桿菌進行改造，獲得耐熱突變菌株，改造后的耐熱菌株與巨大芽孢桿菌搭配混菌發(fā)酵，其在33℃時糖酸轉化率有了顯著提升，達到了94%左右。相關代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)在酮古龍酸桿菌和相關維生素C生產菌株中，存在一種能夠將目標產物2-KGA轉化為副產物L-艾杜糖酸的2-KGA還原酶，Saito等人對由葡萄糖一步發(fā)酵生產2-KGA的重組菌株進行誘變，得到阻斷L-艾杜糖酸代謝途徑的酮古龍酸桿菌突變菌株，使2-KGA的產量菌提高一倍左右。

2優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境

陳堅教授課題組還通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中的物質分析，確定了與細胞生物量、糖酸轉化率密切相關的物質，包括甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸、煙酸、蘇氨酸等，并通過最優(yōu)化方法確定了最佳含量。天津大學高赟等人運用過程分析技術（PAT）策略，對維生素C二步發(fā)酵全過程進行了營養(yǎng)組學研究。利用GC-TOFMS和ICP-AES建立了培養(yǎng)基中化學成分和元素的檢測體系，運用正交偏最小二乘判別分析法（OPLS-DA）動態(tài)篩選協(xié)同促進2-KGA的積累的關鍵物質變化規(guī)律，有助于維生素C工業(yè)生產過程可控性的提高。馬倩等人發(fā)現(xiàn)了在酮古龍酸桿菌純培養(yǎng)中加入還原型谷胱甘肽，提高反應體系的還原性，能夠提高菌體的生物量和產酸能力，通過透射電子顯微鏡和掃描電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)還原型谷胱甘肽處理的酮古龍酸桿菌菌體長度增長4-6倍，同時形成了內膜，通過借助蛋白質組學手段，發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽能夠促進酮古龍酸桿菌轉運TPP的能力，從而促進PPP和TCA循環(huán)，產生更多ATP和NADPH供給細胞代謝，抵抗活性氧攻擊。紀凱等人發(fā)現(xiàn)金屬離子Fe3+、Mn2+和Mg2+有助于細胞生長產酸，通過最優(yōu)化方法，確定了各種金屬離子的最佳濃度。紀凱等人還對不同溶氧濃度對2-KGA關鍵合成酶活性的影響進行了深入的研究，研究表明高溶氧條件適合菌體生長，而不利于產酸；低溶氧水平菌體有利于菌體產酸，但對菌體生長不利。鄭巧雙等研究了稀土離子及其配合物對混菌發(fā)酵產酸的影響，La3+，Ce3+，Nd3+和Sm3+等稀土離子在較低濃度下有促進2-KGA生成且縮短發(fā)酵時間的作用，而EDTA鑭、檸檬酸鑭等對2-KGA生成有抑制作用。研究表明，酮古龍酸桿菌和巨大芽孢桿菌的生長最適pH值分別是6和8，張靜等人通過分階段控制培養(yǎng)環(huán)境pH的策略，控制不同階段的優(yōu)勢菌種，以實現(xiàn)對2-KGA合成的最佳調控。

3適應性進化策略

鄒旸等人以強化兩菌相互作用作為切入點，采用混菌適應性進化手段成功的實現(xiàn)了提高2-酮基-L-古龍酸產率的目標，為進一步改造維生素C生產菌株提供了新思路?；炀w系在為期150天的適應性進化過程中快速進化達到穩(wěn)定狀態(tài)，表現(xiàn)為2-KGA轉化率、pH值、酮古龍酸桿菌菌數(shù)和蠟狀芽孢桿菌菌數(shù)在前50天中較大波動后達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)。通過對分純后的酮古龍酸桿菌和蠟狀芽孢桿菌單菌進行分析可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷適應性進化的酮古龍酸桿菌和蠟狀芽孢桿菌，對培養(yǎng)基環(huán)境的適應能力及生長能力有很大提高，且酮古龍酸桿菌產酸能力有了顯著提高，進化150天的酮古龍酸桿菌產酸能力比原始菌株提高了106.4%。對進化后菌株經(jīng)交叉搭配發(fā)酵，表現(xiàn)為最佳混菌組合2-KGA轉化率達到了93%，遠高于原始菌株的77%。通過代謝水平分析發(fā)現(xiàn)，進化后酮古龍酸桿菌、蠟狀芽孢桿菌與原始菌株相比存在明顯的代謝差異，進化后兩菌相互配合更加協(xié)調，對胞內營養(yǎng)物質的利用能力逐漸提高，有助于目標產物2-KGA的生成。

4結語

以上研究為在混菌中達到提高目標產物產量這一目的提供了新的例證，為進一步優(yōu)化維生素C生產工藝、提高維生素C產量提供了新思路。

參考文獻

[1]趙世剛，王陶，余曾亮.維生索C二步發(fā)酵中離子注入誘變巨大芽孢桿菌的生物學效應[J].激光生物學報，2007，16（4）：455-459.

[2]郭立格，劉其友，楊潤蕾等.從空間搭載Vc生產菌株中篩選高產菌株[J].河北大學學報（自然科學版），2004，24（3）：284-288.

收稿日期：2015-02-10

作者簡介：鄒旸（1985—），男，漢族，天津人，博士研究生，工程師，研究方向：食品科學。