摘要：采用系統(tǒng)溶劑法，分別以水、草酸銨（3%）、堿（5%NaOH）為溶劑對(duì)樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取，得率分別為17.53%、7.73%、1.91%。利用光波作為輔助手段，提取得率分別為22.32%、9.10%、2.23%，證明光波輔助能有效提高樺褐孔菌多糖的提取得率。利用乙醇分級(jí)對(duì)樺褐孔菌多糖進(jìn)行進(jìn)一步分離，獲得三種不同的多糖組分：IOP40、IOP60、IOP80，含量分別為：19.4%、41.12%、9.23%。進(jìn)而利用Sevage法和大孔樹脂法兩種方法對(duì)樺褐孔菌去除蛋白和色素，并對(duì)這兩種方法進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化，為進(jìn)一步純化樺褐孔菌多糖提供了最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。其中Sevage法最佳脫蛋白條件是：Sevage試劑添加量為多糖提取液體積的2倍，氯仿正丁醇體積比為4：1，振搖時(shí)間為25 min，脫蛋白次數(shù)3次。大孔樹脂對(duì)樺褐孔菌多糖的最佳脫色工藝為：上樣濃度10 mg/mL、pH為7、脫色溫度40℃、脫色時(shí)間為10 h。

關(guān)鍵詞：樺褐孔菌 多糖 分離和純化

中圖分類號(hào)：TQ914.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）06-0000-00

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，在俄羅斯通常被稱為chaga。藥用真菌，生長(zhǎng)于樺樹上，其子實(shí)體為塊狀形態(tài)，呈現(xiàn)出類似于碳的黑色。長(zhǎng)久以來(lái)，樺褐孔菌在俄羅斯民間作為一種純中藥用于治療疾病，可以說(shuō)是21世紀(jì)的功能性保健食品。

多糖是由十個(gè)以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，為了研究多糖的結(jié)構(gòu)和活性，首先要對(duì)多糖進(jìn)行提取、分離和純化。最為常用的多糖提取方法為熱水浸提[1]；為了更有效的提高多糖得率，可考慮物理輔助的方法；提取后的多糖可利用超濾或者乙醇沉淀對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)[2]；分級(jí)后的多糖可以進(jìn)行脫色脫蛋白等進(jìn)一步純化處理。

1材料與方法

1.1材料

原料：樺褐孔菌粉，來(lái)自聊城大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)儀器：Cha-s往復(fù)式氣浴恒溫振蕩器；恒流泵；健源JY-A5型光波爐；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Avanti J-301 centrifuge（BECKMAN COULTER）；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（濟(jì)南博華儀器有限公司）；pH計(jì)（上海世儀精密儀器有限公司）等。移液槍、容量瓶、量筒、移液管、玻璃棒、燒杯、試管、膠頭滴等。

化學(xué)試劑：苯酚、氫氧化鈉、葡萄糖、草酸銨、PBS緩沖液（pH7.4）、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、中性蛋白酶等均為分析純?cè)噭徽麴s水、去離子水、AB-8大孔樹脂、大孔樹脂DA201、大孔樹脂D101、大孔樹脂DM301、D301G、樹脂來(lái)自天津生化試劑生產(chǎn)廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1采用不同溶劑提取樺褐孔菌多糖的比較研究

（1） 水提樺褐孔菌多糖。干燥的樺褐孔菌粉，加入20倍量乙醇（95%）做預(yù)處理，靜置過(guò)夜。次日得濾渣，以料液比1：30加入蒸餾水，95℃提取2.5 h。冷卻后進(jìn)行抽濾，濾液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適當(dāng)濃縮，向濃縮后的溶液中緩緩加入4倍體積的乙醇（95%），邊加邊攪拌，4℃靜置12 h，醇沉后的溶液再次進(jìn)行抽濾，保留濾渣，進(jìn)而進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，至恒重時(shí)即得水提取粗多糖，稱重計(jì)算得率。

（2） 草酸銨提取樺褐孔菌多糖。干燥的樺褐孔菌粉，加入20倍量乙醇（95%）做預(yù)處理，靜置過(guò)夜。次日得濾渣，以料液比1：30加入3%草酸銨溶液，95℃提取2.5 h。冷卻后進(jìn)行抽濾，濾液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適當(dāng)濃縮，將濃縮后的溶液置于透析紙（蒸餾水煮沸20 min）中于流動(dòng)水中透析24h。透析液再次經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后置于鼓風(fēng)干燥箱，進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，至恒重，即得到草酸按提取粗多糖（見圖1-2）。稱重計(jì)算得率。

（3）堿提取樺褐孔菌多糖。干燥的樺褐孔菌粉，加入20倍量的乙醇（95%）做預(yù)處理，靜置過(guò)夜。次日得濾渣，以料液比1：30加入5%NaOH溶液，95℃提取2.5h。冷卻后進(jìn)行抽濾，濾液用HCl中和后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適當(dāng)濃縮，向濃縮后的溶液中緩緩加入4倍量體積的乙醇（95%），邊加邊攪拌，4℃靜置12 h，醇沉后溶液再次進(jìn)行抽濾，保留濾渣，進(jìn)而進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，至恒重時(shí)即得堿提取粗多糖（見圖1-3）。稱重計(jì)算得率。

1.2.2 光波輔助提取樺褐孔菌多糖的研究

以光波爐作為輔助，光波功率為1200W，在料液比1：30、提取溫度95℃、提取時(shí)間2.5 h的條件下分別以水、草酸銨（3%）、堿（5%NaOH）為溶劑進(jìn)行提取。分別得多糖，稱重計(jì)算得率。

1.2.3 樺褐孔菌多糖的乙醇分級(jí)

在不同濃度的乙醇中，多糖具有不同的溶解度，因此，按比例加入乙醇進(jìn)行分步沉淀。稱取粗多糖，配制成2%的多糖溶液，向其中緩緩加入95%的乙醇，使溶液濃度達(dá)到40%，8000r/min條件下離心20 min，得沉淀凍干，所得即IOP40，稱重計(jì)算得率。同樣，95%乙醇添加到溶液濃度為60%、80%，并依此在8000r/min條件下離心20 min，得沉淀并凍干，分別得到IOP60和IOP80，稱重計(jì)算得率。

1.2.4 Sevage法去除樺褐孔菌多糖蛋白質(zhì)雜質(zhì)的研究

以上述方法提取得到的IOP60為實(shí)驗(yàn)原料進(jìn)行Sevage法去蛋白實(shí)驗(yàn)，Sevage法：利用蛋白質(zhì)在三氯乙烷等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，將提取液與Sevage試劑混合，振蕩，離心，變性后的蛋白質(zhì)介于提取液與Sevage試劑交界處。此法的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，不會(huì)引起多糖的變性。

（1） 樺褐孔菌粗多糖IOP60母液的配制。將樺褐孔菌粗多糖IOP60用蒸餾水溶解，離心，配成10 mg/mL粗多糖溶液，作為母液備用。

（2）Sevage法去蛋白的正交試驗(yàn)。以除蛋白次數(shù)（ A ） 、氯仿與正丁醇體積比（ B ） 、振搖時(shí)間（ C ） 、Sevage 試劑添加量（ D ） 四個(gè)因素為自變量， 以蛋白去除率和多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定Sevage法去蛋白的最佳工藝組合條件。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

2結(jié)果與分析

在料液比為1：30、溫度95℃、提取時(shí)間2.5 h的條件下，分別以水、草酸銨（3%）、堿（5%NaOH）為溶劑，對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行多糖提取，得率分別為17.53%、7.73%、1.91%。利用光波作為輔助手段，提取得率分別為22.32%、9.10%、2.23%，實(shí)驗(yàn)證明光波輔助法大大提高了樺褐孔菌多糖的提取得率，其中水提得率最高，結(jié)果見圖1，且光波輔助較常用的微波輔助方法還具有無(wú)輻射的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。

圖1 光波輔助對(duì)樺褐孔菌多糖提取得率的影響

3結(jié)語(yǔ)

研究表明，光波輔助法（光波功率1200 W）大大提高了樺褐孔菌多糖的提取得率，其中水提得率最高，且光波輔助較之常用的微波輔助方法還具有無(wú)輻射的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。Sevage法脫蛋白的最佳條件是：Sevage試劑添加量為多糖提取液體積的2倍，氯仿正丁醇體積比為4：1，振搖時(shí)間為25 min，脫蛋白次數(shù)3次。DM301大孔樹脂法脫色的最佳條件是：上樣濃度為10 mg/mL、pH為7、脫色溫度40℃、脫色時(shí)間為10 h。

4 討論

本文中，系統(tǒng)溶劑法提取樺褐孔菌多糖，由于本實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)故障，提取均采用了抽濾的方法，這也可能為影響得率的主要因素。

參考文獻(xiàn)

[1]陳義勇.樺褐孔菌多糖純化、結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤機(jī)制研究[D].江南大學(xué)，2010.

[2]張麗霞.樺褐孔菌多糖結(jié)構(gòu)及生物活性研究[D].東北師范大學(xué)，2011.

收稿日期：2015-03-20

作者簡(jiǎn)介：朱曉麗（1987—）女，山東青島人，學(xué)歷：碩士，研究方向：微生物學(xué)（多糖）。