侯高杰 邱愛華 王茜

摘要 [目的]從轉錄水平揭示ALMT和MATE基因在大豆耐鋁中的作用，為遺傳改良獲得抗性種質提供依據。[方法]對2個大豆品種進行Al處理，取脅迫后6 h（短期）、2 d（中期）和12 d（長期）的根尖提取RNA，采用qRT-PCR檢測耐鋁相關基因的時空表達。[結果]以MTP和UBC2為內參時，ALMT基因在鋁處理2 d后的BX10中表達量與對照相比變化最大，在BD2中處理12 d后的表達量最大；當使用不同的內參校準時，MATE在同一個品種中的表達量存在差異，且在同一品種處理的3個時間點的變化趨勢也不一致。[結論]不同的內參基因進行校準時，基因的表達量不同，使用2個或2個以上的內參基因進行校正能夠提高結果的準確性，基因的表達變化為研究植物耐鋁機制提供理論基礎。

關鍵詞 大豆；鋁毒；基因表達

中圖分類號 S788 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-034-03

大豆（Glycine max L.），是我國重要的油料作物，是食物中不可缺少的主要蛋白質來源，由于近幾年作物種植模式的調整，使木薯、甘蔗等在廣西的種植面積不斷擴大，大豆種植面積逐漸減少。近些年廣西區(qū)內自產的大豆遠遠不能滿足自身需求，需要每年從其他地方調入大量的大豆[1]，且廣西區(qū)的土壤為酸性土壤，因此，迫切需要引進優(yōu)良的大豆品種來增加廣西大豆的產量以滿足本地消費群體的需求。鋁毒被認為是在酸性土壤上限制作物生長與產量的主要因子[2]。鋁對植物毒害作用最明顯的特征是鋁抑制了植物根尖細胞伸長和細胞分裂[3]，Delhaize等[4]研究表明，根尖積累的Al及其產生的機械損傷遠遠超過根其他位置。因此根尖被認為是植物受鋁毒脅迫的首要作用位點[5]。植物有機酸的分泌是植物一種普遍適應鋁毒的機制，并認為是一個真正抵御鋁毒的機制。研究最多的有機酸類包括蘋果酸與檸檬酸，已知鋁誘導下植物蘋果酸與檸檬酸的分泌分別是由蘋果酸通道蛋（Aluminum-activated malate transporter， ALMT）和多藥及毒性復合物的排出轉運蛋白（multidrug and toxic compound extrusion， MATE）調控。筆者前期已經對BX10與BD2 2個品種在鋁毒脅迫下有機酸種類和分泌量進行了相關研究，在此基礎上，對大豆進行鋁毒處理，研究相關基因的表達變化，探究大豆的耐鋁機制，為培育高產、抗鋁性強的品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。大豆雙抗品種巴西10號（簡稱BX10）和對照品種本地2號（簡稱BD2）。

1.1.2 主要試劑。RNA提取所用試劑盒及DNaseⅠ購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScript Reverse Transcriptase及SYBR Premix Ex Taq II購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要儀器。J-25高速冷凍離心機（Beckman），凝膠成像系統(tǒng)（BioRad），DEC-810型PCR儀，定量PCR儀器（德國耶拿）。

1.2 方法

1.2.1 大豆培養(yǎng)。挑選相同大小的種子，使用30%的H2O2消毒約2 min，之后轉入飽和的CaSO4中處理30 min，轉入至沙土中培養(yǎng)，大豆幼苗長至7～8 cm時移栽到1/5Hoagland營養(yǎng)液中。鋁毒處理（1/5Hoagland營養(yǎng)液，加入終濃度為0.5 mm/L的AlCl3）和對照（1/5Hoagland營養(yǎng)液，pH 4.5），用HCl調節(jié)培養(yǎng)液的pH，水培過程中每2 d換1次培養(yǎng)液，每小時通氣10 min，每天8：00和18：00各調整1次pH，收集脅迫處理6 h、2 d與12 d處理與對照的根尖材料。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成。按照上海生工柱式RNA提取試劑盒說明書對材料的RNA進行提取，用DNaseⅠ對DNA進行消化，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用Thermo Scientific NanoDrop 2000c檢測總RNA濃度及純度。用PrimeScript Reverse Transcriptase進行反轉錄試驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR引物設計。在NCBI上查找ALMT、MATE。用primer3.0（http：//primer3.ut.ee/）在線設計和Primer5.0軟件設計，以MTP和UBC2為內參基因，前期對大豆22個內參基因進行穩(wěn)定性篩選，用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt值分析法分析基因的穩(wěn)定性，得到MTP和UBC2為大豆在鋁脅迫下表達比較穩(wěn)定的基因，適合作為大豆耐鋁研究的內參基因。

1.2.4 目的基因克隆與轉化。對目的基因進行PCR擴增，將PCR產物進行電泳，膠回收，與載體連接，轉化，之后送于華大基因測序。

1.2.5 熒光定量PCR反應。對反轉錄cDNA模板進行熒光定量PCR擴增，10 μl反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa） 5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，cDNA模板0.125 μl，用ddH2O補足10 μl。反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火與延伸30 s，并收集熒光信號，45個循環(huán)，65～95 ℃生成熔解曲線，對基因表達分析時采用2-ΔΔCt法[6]對數據進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計分析 采用 Excel 2007對熒光定量數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 ALMT基因表達 使用MTP和UBC2 2個內參基因校準ALMT基因的表達，結果見圖1。以MTP為內參時，ALMT在鋁處理6 h、2 d、12 d后的BX10品種中的相對表達量分別是0.44、7.58、2.68；在鋁處理6 h、2 d、12 d后的BD2品種中的相對表達量分別是0.19、0.23、1.58。以UBC2為內參時，ALMT在鋁處理6 h、2 d、12 d后的BX10品種中的相對表達量分別是0.65、16.34、2.38；在鋁處理6 h、2 d、12 d后的BD2品種中的相對表達量分別是0.15、0.33、3.08。對比2個內參的校準結果發(fā)現，在BX10品種中，鋁處理6 h后的表達量低于對照的表達量，處理2 d后表達量明顯高于對照，在處理12 d后表達量降低，但仍高于對照水平；在BD2品種中基因的相對表達量在6 h、2 d后，均低于對照水平，在處理12 d后的表達量呈升高趨勢。

2.2 MATE基因表達 使用MTP和UBC2 2個內參基因校準MATE基因的表達，結果見圖2。以MTP為內參時，MATE基因在BX10品種和BD2品種進行鋁處理6 h、2 d、12 d后的相對表達量分別是1.15、1.16、1.18和1.62、0.81、0.79；以UBC2為內參時，MATE基因在BX10品種和BD2品種進行鋁處理6 h、2 d、12 d后的相對表達量分別是1.68、2.50、1.04和1.30、1.19、1.54。對比2個內參的校準結果發(fā)現，MATE基因在同一個品種3個時間點的表達變化量及變化趨勢不同，以MTP為內參時，基因在BX10品種中3個時間點的表達量沒有很大差異，BD2處理6 h后是對照的1.62倍，在2 d和12 d低于對照的表達量；以UBC2為內參時，基因在BX10中6 h、2 d的表達量是對照的1.68和2.50倍，高于以MTP為內參時的1.15和1.16，在12 d中的表達為對照的1.04倍，低于以MTP為內參時的1.18倍，以UBC2為內參時，MATE基因在處理6 h的BD2品種中的表達為1.30，低于以MTP為內參時的1.62，在處理2 d、12 d的BD2中的表達量是1.19和1.54，高于以MTP為內參的0.81和0.79。其結果差異是由使用不同內參基因校準時引起的，同時也說明穩(wěn)定性的內參基因對于試驗結果的促進作用，采用多個內參基因進行分析可以使結果更加可靠。

3 結論與討論

ALMT基因編碼的是位于細胞膜上的蘋果酸轉運蛋白基因，該蘋果酸轉運蛋白的功能是將蘋果酸從細胞膜內轉運至膜外，通過蘋果酸與鋁在細胞膜外的絡合作用，形成無毒的絡合物，降低鋁的毒害作用。Ligaba等[7]根據擬南芥AtALMT1基因序列設計簡并引物克隆了油菜中編碼鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因BnALMT1和BnALMT2，將油菜的2個基因在蟾蜍卵母細胞和煙草細胞中過量表達，結果表明，這2個基因均參與鋁誘導的蘋果酸分泌，從而提高油菜抗鋁毒能力[8]。該試驗結果顯示，ALMT基因在BX10品種處理2 d后的表達量升高，推測該基因可能參與了植物的耐鋁機制，而該基因在BD2品種處理12 d后緩慢增加，在BD2中也可能有該基因參與植物的耐鋁機制，可能由于BX10品種是雙抗品種，耐鋁性比BD2品種好，會使ALMT基因在2個大豆品種中的表達在時間和量上存在差異。

MATE是一個新的轉運蛋白家族，廣泛存在于微生物、植物和哺乳動物細胞內，Magalhaes等[9]從高粱中分離鑒定了一個耐Al基因sbMATE，Al脅迫下，sbMATE的表達量與檸檬酸的分泌速率呈正相關。過量表達sbMATE的轉基因擬南芥耐Al性與對照相比明顯增強，Eticha等[10]通過構建菜豆的SSH文庫發(fā)現，與大豆根尖細胞的鋁誘導檸檬酸分泌相關的MATE基因在鋁脅迫下上調表達。該試驗中MATE基因在測定的時期沒有明顯的表達變化，可能是由于該試驗的取樣時期較少，還不能夠完全地表現出MATE基因不同時期的表達變化。

參考文獻

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