陳建國 梁寒峭 吾布利·卡地爾 趙婷 程池

摘要 [目的]研究新疆“生命營養(yǎng)液”體外抗HIV-1活性，并對其作用機制進行初步探討。[方法]采用MTT比色法，檢測“生命營養(yǎng)液”的細(xì)胞毒性；用攜帶熒光素酶基因的HIV-1假病毒感染體系，檢測“生命營養(yǎng)液”體外抗HIV-1活性，分析“生命營養(yǎng)液”體外抗HIV-1機制。[結(jié)果]“生命營養(yǎng)液”抑制HIV-1感染活性的半數(shù)有效濃度（IC50）為1.784 mg/ml，治療指數(shù)（TI）為7.22，其作用方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518。[結(jié)論] “生命營養(yǎng)液”具有抗HIV-1活性，其作用機制可能抑制病毒的整合。

關(guān)鍵詞 “生命營養(yǎng)液”；HIV-1；假病毒；熒光素酶；機制

中圖分類號 S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-008-02

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），由人類免疫缺陷病毒HIV引起。目前，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法是目前臨床廣泛使用的治療艾滋病的方法，但此療法價格昂貴， 毒副作用大，而且易引起病毒產(chǎn)生變異性和耐藥性[1-2]。近些年來，人們不斷從天然植物中分離得到許多具有抗HIV活性的成分（例如黃酮類、生物堿類、香豆素類、木脂素類、多糖等化合物）[3-9]。這些天然成分具有專屬性強、毒副作用少等優(yōu)點，現(xiàn)已成為抗HIV藥物研究的新趨勢。

“生命營養(yǎng)液”以核桃、巴旦木、杏仁、黃豆、綠豆、大米、干鮮果類和蔬菜類等50多種新疆地區(qū)特產(chǎn)的天然果蔬為原料，結(jié)合傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代生物技術(shù)，經(jīng)過獨特的發(fā)酵工藝制備而成。它是一種新疆地區(qū)特色的具有保健功能的飲料[10]。

在新疆地區(qū)，維吾爾族民間常飲用“生命營養(yǎng)液”，具有增強免疫力、抗病毒、抗氧化、促進細(xì)胞再生、抑菌等功能[10-11]，也常作為輔助治療艾滋病的保健飲品。但是，目前仍缺乏對“生命營養(yǎng)液”的深入研究，尚無有關(guān)“生命營養(yǎng)液”抗HIV病毒的報道。因此，筆者采用體外細(xì)胞模型，初步分析“生命營養(yǎng)液”體外抑制HIV-1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

“生命營養(yǎng)液”，由新疆埃杜升（ ALDOS） 生物開發(fā)有限公司提供。胎牛血清為 GIBICO、DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基，均購自美國 Invitrogen 公司。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Efavirenz（EFV）和整合酶Raltegravir （MK-0518）均由NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供。DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、DNA提取試劑TRIZOL購自美國Invitrogen公司。熒光素酶活性測定試劑盒Luciferase Assay System購自美國Promega公司。質(zhì)粒小提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國 TIgma 公司。pNL4.3.Env-.Luc質(zhì)粒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院岑山教授提供；pHCMV-G （VSV-G）質(zhì)粒由美國Johnny He教授提供。

1.2 儀器

紫外分光光度計SmartSpecTM Plus spectrophotometer購自美國Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀Tristar LB 941、Centro XS3 LB 960均購自德國Berthold公司。Stratagene MX3000P熒光定量PCR儀購自Agilent公司。

1.3 “生命營養(yǎng)液”預(yù)處理

200 ml“生命營養(yǎng)液”經(jīng)離心、過濾得到122.5 ml上清液，得率61.25%，凍干后得到1.84 g樣品。然后，將凍干粉溶于DMSO中，配成不同濃度的培養(yǎng)液，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，共7個稀釋度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎上皮細(xì)胞293T用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

人T淋巴細(xì)胞SupT1用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.5 HIV-1假病毒的制備

pNL4.3.Env-.Luc（表達(dá)具有熒光素酶報告基因，但包膜蛋白缺失的HIV-1病毒）和pHCMV-G （VSVG，水泡性口膜炎病毒外殼糖蛋白）共轉(zhuǎn)染293T產(chǎn)生的VSVG假型HIV-1病毒，-80 ℃保存。

1.6 “生命營養(yǎng)液”細(xì)胞毒性的測定

采用MTT法。按細(xì)胞數(shù)3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待24 h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的藥物處理，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，共7個稀釋度。每個濃度設(shè)3個平行孔。藥物處理72 h后，除去上清液。每孔加入100 μl 500 mg/ml MTT，37 ℃孵育2 h后小心吸除培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，混勻，用酶標(biāo)儀測定570 nm 吸收度（A），將各測試孔的A值減去本底A值（完全培養(yǎng)基加 MTT，無細(xì)胞）。

細(xì)胞存活率（%）=（加藥細(xì)胞A-本底A）/（對照細(xì)胞A-本底A）×100%

繪制抑制曲線，計算半數(shù)抑制（毒性）指數(shù)（TC50）。

1.7 “生命營養(yǎng)液”抑制HIV-1感染活性的評價

[12] SupT1

細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，以MOI=1接種病毒，加入不同濃度的藥物處理，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，設(shè)3組平行。然后，置于濃度5% CO2，37 ℃培養(yǎng)48 h，測定感染細(xì)胞中熒光素酶活性。取50 μl細(xì)胞懸液，加入2×裂解液50 μl，37 ℃孵育半個小時后，取其中5 μl細(xì)胞裂解液，加40 μl熒光素酶底物，在多功能微孔板檢測儀EnViTIon 2104-0010上測定熒光素酶活性，計算不同濃度樣品對病毒感染性的影響，并利用origin 軟件計算樣品抑制HIV-1活性的半數(shù)抑制指數(shù)（IC50）。應(yīng)用治療指數(shù)（TI），評價“生命營養(yǎng)液”的抗HIV-1活性。

TI= TC50/IC50[13-14]

當(dāng)TI>2時，為有效低毒；當(dāng)1

1.8 “生命營養(yǎng)液”抗HIV作用機制的初步分析

[12] HIV侵襲靶細(xì)胞的主要過程為識別和黏附、膜融合、逆轉(zhuǎn)錄、整合和翻譯、裝配和釋放。一般，將整合以前歸為早期事件，之后為晚期事件。選用針對病毒復(fù)制不同時期的靶點明確的藥物，選取非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑Efavirenz（EFV）和整合酶抑制劑Raltegravir （MK-0518）為陽性藥，選擇0、0.5、1、2、4、6、7和21 h作為加藥時間點，并且在感染病毒后確保病毒在同一時間進入生活周期，分別測出在不同時間點藥物對病毒復(fù)制的影響，從而初步判斷“生命營養(yǎng)液”抗HIV的作用機制。

2 結(jié)果與分析

2.1 “生命營養(yǎng)液”對人淋巴細(xì)胞SupT1細(xì)胞的毒性作用

采用MTT方法，測定不同濃度“生命營養(yǎng)液”對人淋巴細(xì)胞SupT1細(xì)胞的毒性。由圖1可知，“生命營養(yǎng)液”對SupT1細(xì)胞增殖的抑制率與其濃度呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，其TC50為0.247 mg/ml。

2.2 “生命營養(yǎng)液”抑制HIV-1感染的作用

由圖2可知，“生命營養(yǎng)液”對HIV-1感染的抑制率與其濃度呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，表明它具有一定的抗HIV-1的作用。其抑制HIV-1感染的IC50為1.784 mg/ml，TI為7.22，屬于有效低毒。

2.3 “生命營養(yǎng)液”抗HIV作用靶點的初步判定

由圖3可知，“生命營養(yǎng)液”的作用方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518，同時對逆轉(zhuǎn)錄酶的活性也有一點影響，但對病毒的進入及其他早期環(huán)節(jié)沒有明顯影響。由此可知，“生命營養(yǎng)液”是通過抑制HIV-1的整合而發(fā)揮作用的。

3 結(jié)論

“生命營養(yǎng)液”是新疆地區(qū)特色的保健飲品，具有多種重要的生理活性。該研究首次對“生命營養(yǎng)液”抗HIV-1病毒作用進行了初步分析。結(jié)果表明，“生命營養(yǎng)液”對艾滋病毒HIV-1感染有抑制作用，IC50為1.784 mg/ml，TI為7.22，屬于有效低毒。該研究采用非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑efavirenz（EFV）和整合酶Raltegravir （MK-0518）為陽性對照藥。研究表明，“生命營養(yǎng)液”抑制HIV-1感染的方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518，說明它可能通過抑制HIV-1病毒的整合而發(fā)揮作用。

“生命營養(yǎng)液”雖被證實具有體外抗HIV-1的作用，但仍有許多問題亟待解決。首先，它發(fā)揮抗HIV-1作用的主要物質(zhì)需要深入研究；其次，需要通過動物模型，研究它對免疫功能低下的調(diào)節(jié)作用、劑量關(guān)系；最后，還應(yīng)加強對它發(fā)揮增強免疫力作用內(nèi)源性分子靶點及信號通路的研究，只有在分子水平上研究其機制，才能發(fā)現(xiàn)問題的本質(zhì)。

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