劉燕青，黃 健，黃韻祝＊＊，婁方方，孔維瑩

(1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學附院 生化科，貴州 貴陽 550004)

組蛋白去乙?；?(HDAC2)屬于I 類組蛋白去乙?；福浯呋Y(jié)構(gòu)含有與鋅離子螯合的保守氨基酸殘基，能調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導和基因表達［1］。HDAC2 在腫瘤組織中有異常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在某些特定的腫瘤中HDAC2的刪除可導致腫瘤細胞生長停滯和凋亡［2－5］。本課題組前期研究利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了3 對針對HDAC2 基因的慢病毒重組表達質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3，并經(jīng)酶切鑒定和測序驗證證實3 對重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。本研究利用課題組構(gòu)建的HDAC2 基因重組慢病毒表達質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA，制備高濃度的慢病毒顆粒，感染人肝癌細胞株HepG2，觀察HDAC2 基因的mRNA 和蛋白水平表達，從而判斷其干擾效率，為后續(xù)研究HDAC2 基因的功能及作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pLKO.1-puro 慢病毒表達載體與psPAX2 及pMD2.G 質(zhì)粒(美國addgene 公司)，人肝癌HepG2細胞株與stbl2 感受態(tài)細胞(課題組保存)，人胚腎293T 細胞(武漢大學典型保藏中心)，20 bp DNA Ladder 與SYBR?Premix Ex TaqTMII(日本Takara公司)，胎牛血清及DMEN 高糖培養(yǎng)基(Gibco 公司)，陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、opti-MEM(Invitrogen 公司)，鼠抗人HDAC2 單克隆抗體(Abcam 公司)，LaminB1 抗體(武漢三鷹)，細胞核與細胞漿蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG 二抗和BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，PVDF 膜(Millipore 公司)，熒光倒置顯微鏡(NIKON)，恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2 細胞與293T 細胞復蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含100 mL/L 胎牛血清(FBS)的高糖DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 篩選質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑最適比例 先對脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化，選用理論上不會影響細胞生長的對照質(zhì)粒pEGFP-N1。將質(zhì)粒pEGFP-N1 轉(zhuǎn)化stbl2 感受態(tài)細胞，用含100 mg/L 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)質(zhì)粒pEGFP-N1，挑選單克隆鑒定，搖菌擴大、無內(nèi)毒素抽提。取對數(shù)生長期293T 細胞鋪6 孔板，1×105/孔，培養(yǎng)24 h 使細胞匯合度達70%～90%。實驗分5 組，即質(zhì)粒pEGFP-N1(μg)與脂質(zhì)體Lipofectamine2000(μL)以1 ∶1、1∶2、1∶3、1∶4及1∶5的比例轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T，分別取5 份3 μg pEGFP-N1 溶解至500 μL opti-MEM 中，分別吸取3 μL、6 μL、9 μL、12 μL、15 μL Lipofectamine2000 加入到500 μL opti-MEM，室溫孵育5 min，然后將各組Lipofectamine2000 稀釋液加到相應(yīng)的質(zhì)粒中，室溫靜置20 min，將混合物逐滴加入6 孔板，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)8 h 后換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

1.2.3 慢病毒包裝 將前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 與包裝質(zhì)粒psPAX2 和包膜質(zhì)粒pMD2.G 采用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染到293T 細胞中，包裝成慢病毒顆粒。于100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)，置37 ℃、50 mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。去內(nèi)毒素大提各組重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 和包裝質(zhì)粒psPAX2 和包膜質(zhì)粒pMD2.G。轉(zhuǎn)染前1 天，胰酶消化對數(shù)生長期293T細胞，用無抗生素培養(yǎng)基接種25 cm2培養(yǎng)瓶，8×105/瓶培養(yǎng)過夜，使細胞密度達50%～60%匯合度，進行轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒(μg)∶脂質(zhì)體(μL)按最優(yōu)比例，將各組質(zhì)粒(空載pLKO.1、重組質(zhì)粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、2、3、neg 8 μg，psPAX2 6 μg，pMD2.G 2 μg)與低血清Opti-MEM 培養(yǎng)基在EP管中稀釋至500 μL，取另一EP 管稀釋48 μL 脂質(zhì)體Lipofectamine2000 于Opti-MEM 培養(yǎng)基至500 μL，室溫孵育5 min，將含Lipofectamine2000 的混合液加入質(zhì)?；旌弦褐谢靹?，室溫靜置20 min。用無血清無抗生素DMEM 洗滌293T 細胞兩遍，加入4 mL無血清無抗生素DMEM，然后將1 mL 質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復合物逐滴加到細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、50 mL/LCO2培養(yǎng)8 h 后，換成無抗生素含100 mL/L 胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);以pEGFP-N1 質(zhì)粒同步轉(zhuǎn)染檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h 后更換為完全培養(yǎng)基，48 h 收集含慢病毒顆粒的細胞上清液，4 ℃保存。更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后第2 次細胞上清液，與第1 次收集的上清液混合，室溫2 000 r/min離心5 min 去除細胞碎片，收集病毒上清液，再經(jīng)0.45 μm 濾器過濾病毒上清液，分裝，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 感染靶細胞及細胞形態(tài)觀察 取處于對數(shù)生長期肝癌HepG2 細胞，以不含抗生素100 mL/L胎牛血清加DMEM 接種至6 cm 培養(yǎng)皿，7×105個/皿，37 ℃，50 mL/LCO2培養(yǎng)24 h，細胞融合率為70%～90%時進行感染。實驗分為6 組:未處理HepG2 細胞組(空白對照組)、空載體對照組(pLKO.1)、陰性對照組(pLKO.1-HDAC2-shRNAneg)、pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 3 組?？瞻讓φ战M不加入任何病毒顆粒換液后繼續(xù)培養(yǎng)，空載體對照組、陰性對照組和pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組細胞中分別加入重組慢病毒顆粒進行細胞感染處理。各感染組先用無血清無抗生素DMEM 洗滌HepG2 細胞兩遍，加入3 mL 無血清無抗生素DMEM，取適量polybrene 加入上述培養(yǎng)基中使其終濃度為5 mg/L，然后將各組2 mL 病毒液逐滴加到細胞培養(yǎng)皿中混勻;37 ℃，50 mL/LCO2培養(yǎng)24 h 后換成無抗生素含100 mL/L 胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);感染48 h 提取RNA 采用實時熒光定量PCR 分析感染后HDAC2 mRNA 水平，感染72 h 后提取細胞核蛋白進行Western blotting 分析。

1.2.5 HDAC2 mRNA 的檢測 pLKO.1-HDAC2-shRNA 慢病毒感染HepG2 細胞48 h 后，提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 為模板應(yīng)用實時熒光定量PCR 檢測HDAC2 mRNA 的表達情況。HDAC2 基因PCR 引物由上海捷瑞公司合成，上游引物為5'-ATTACTGATGCTTGGAGGAGGT-3'，下游引物為 5'-TATTCTGGAGTGTTCTGGTTTG-3';以GAPDH 為內(nèi)參，上游引物為 5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，下游引物為5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。反應(yīng)條件為95 ℃30 s，1 個循環(huán);95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán);95 ℃，5 s，60 ℃1 min，95 ℃，1 個循環(huán);50 ℃30 s，1 個循環(huán)。每組設(shè)3 個復孔，實驗重復3 次。以HepG2 細胞組為空白組，根據(jù)熒光信號得到Ct 值，根據(jù)公式2－△△Ct計算HDAC2 mRNA 的相對表達量。

1.2.6 HDAC2 蛋白的檢測 取感染后72 h 實驗組和對照組細胞，用4 ℃預冷PBS 洗滌細胞，收集細胞并提取細胞核蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝，－80 ℃保存。取20 μg 蛋白加適量2×SDS上樣緩沖液，混勻，沸水浴5 min 預變性，冰上冷卻。經(jīng)10%的SDS-PAGE 電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移250 mA、2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入HDAC2 一抗(1∶5 000)4 ℃緩慢振搖過夜，TBST 洗膜6 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶500)，室溫孵育1 h，洗膜后在暗室內(nèi)用增強型化學發(fā)光(ECL)發(fā)光顯色，膠片曝光。取膠片掃描獲取圖像，計算條帶的灰度值作為蛋白的表達量。以LaminB1 作內(nèi)參照，實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差)表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例優(yōu)化

當質(zhì)?！肔ipofectamine2000 為1∶3時，轉(zhuǎn)染效率能達70%以上。見圖1。

2.2 重組慢病毒顆粒感染后HepG2 細胞形態(tài)變化

感染HepG2 細胞72 h 后，在倒置相差顯微鏡下見到對照組HepG2 細胞生長分裂活躍，形態(tài)規(guī)則，胞核橢圓且位于細胞中央。pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組HepG2 細胞皺縮，形態(tài)多樣，細胞連接消失，胞質(zhì)密度增加，細胞核固縮，染色質(zhì)致密，并邊集于核膜內(nèi)側(cè)，胞質(zhì)中有空泡形成，有凋亡小體產(chǎn)生，可見細胞明顯被抑制。見圖2。

圖1 pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染293T 細胞的熒光表達(200×)Fig.1 Fluorescent observation of EGFP expression of 293T cells after transfection with pEGFP-N1 vector

圖2 自然光下感染的HepG2 細胞形態(tài)(72 h)Fig.2 Inverted microscope observation of cell morphology of HepG2 cells 72h in natural light after transfection with recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA

2.3 慢病毒顆粒感染HepG2 細胞后HDAC2 mRNA 表達及抑制率

慢病毒顆粒感染HepG2 細胞48 h 后，HDAC2基因表達在空載體對照組、陰性對照組與HepG2空白組間，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 3 組與空白對照組、空載體對照及陰性對照組比較，HDAC2 基因mRNA 表達量均有下降，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);其中pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組對HDAC2 mRNA 的抑制率最高，達到82.09%。見表1 和圖3。

2.4 慢病毒顆粒感染HepG2 細胞72 h HDAC2 蛋白表達

HepG2 細胞經(jīng)慢病毒感染72 h 后，在HepG2空白對照、空載體對照及陰性對照組均可見明顯的HDAC2 蛋白表達，但3 組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);包裝的含pLKO.1-HDAC2-shRNA 重組質(zhì)粒的慢病毒顆粒感染細胞后，pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組HepG2 細胞中HDAC2 蛋白條帶均較空白對照組、空載體對照組及陰性對照組明顯減弱，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖4、圖5;pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組和3 組比pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組的條帶更弱，對蛋白表達的干擾效果更好(P ＜0.05);HDAC2-shRNA 1組與HDAC2-shRNA 3 組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

表1 shRNA 對HDAC2 mRNA 的抑制率Tab.1 The suppression rate of HDAC2 mRNA with shRNA

圖3 各組HDAC2 mRNA 相對表達量Fig.3 Relative expression levels of HDAC2 mRNA in the six groups

圖4 pLKO.1-HDAC2-shRNA 轉(zhuǎn)染后HepG2 細胞中HDAC2 蛋白表達(Western blotting)Fig.4 Protein expression of HDAC2 detected by Western blotting analysis in HepG2 cells transfected with pLKO.1-HDAC2-shRNA

圖5 HepG2 細胞HDAC2 蛋白的表達Fig.5 Protein expression of HDAC2 detected by gray value analysis in HepG2 cells transfected with pLKO.1-HDAC2-shRNA

3 討論

從表觀遺傳學來講，腫瘤的發(fā)生主要包括DNA 甲基化、組蛋白乙酰化、染色體重塑和非編碼RNA 調(diào)控等。細胞及有機體內(nèi)組蛋白的乙?；腿ヒ阴；g存在一種受到嚴格控制的動態(tài)平衡，是調(diào)節(jié)基因表達的一個重要因素，這種平衡的打破成為癌癥產(chǎn)生的直接誘因［6］。HDACs 可被募集結(jié)合在特定的啟動子區(qū)，從而導致許多基因轉(zhuǎn)錄受抑制，抑制抑癌基因的表達，因此HDACs 可能成為腫瘤治療的靶點。HDAC2 處于信號轉(zhuǎn)導途徑的下游，有可能在染色體翻譯修飾后對轉(zhuǎn)錄進行快速調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2 過表達與p21 的表達降低密切相關(guān)，抑制HDAC2 表達能上調(diào)p21 的表達和下調(diào)細胞周期蛋白cyclinD1 和cyclinA 的表達，提示HDAC2 在維持代謝平衡、調(diào)控細胞周期及腫瘤生成中可能發(fā)揮著重要作用［7－10］。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC2 可通過多種機制達到促癌作用，而HDAC2的敲除可導致某些腫瘤細胞生長停滯和凋亡;另外，HDAC2 也可通過抑制抑瘤因子p53，p21 和促進原癌基因MYC 的表達，從而建立阻礙細胞凋亡和細胞周期停滯的惡性循環(huán)［11］。

RNA 干擾(RNAi)是在基因的轉(zhuǎn)錄后針對含有特異性序列的mRNA 進行沉默［12］，RNAi 技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能分析、信號轉(zhuǎn)導通路研究和基因治療。由于siRNA 不能在細胞內(nèi)長期存在，無法實現(xiàn)長時間穩(wěn)定的RNA 干擾，慢病毒載體則解決了此問題［13］。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒之一，是一種復制缺陷型病毒載體，以HIV21 為基礎(chǔ)發(fā)展而得，在宿主細胞內(nèi)能以自身RNA 為模板在自身反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，再以堿基配對原則合成雙鏈DNA，經(jīng)環(huán)化后整合到宿主細胞的染色體上并長期表達。目前關(guān)于經(jīng)慢病毒載體介導的目的基因沉默研究也日趨成熟。在本課題組前期研究中，通過利用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了3 條pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質(zhì)粒載體和一條陰性對照載體。采用pLKO.1 慢病毒表達系統(tǒng)，可降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低，瞬時轉(zhuǎn)染半衰期短的問題，且安全性高、操作性簡單。在本實驗中，由于質(zhì)粒和脂質(zhì)體濃度都會不同程度地影響細胞的生長和增殖，為了同時滿足高效轉(zhuǎn)染率和低細胞毒性，首先利用對細胞無毒性的pEGFP-N1 質(zhì)粒，選取幾個比例的質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細胞293T，24 h、48 h 后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光信號表達強度，獲得最適的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例進行下一步實驗。本實驗結(jié)果顯示，當質(zhì)粒:Lipofectamine2000 為1∶3時，轉(zhuǎn)染效率最高，所以本研究的后續(xù)實驗根據(jù)比例來進行瞬時轉(zhuǎn)染靶細胞以及包裝慢病毒能達到很好的效果。慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的效率比質(zhì)粒載體高，本實驗首先運用脂質(zhì)體法介導的轉(zhuǎn)染將構(gòu)建成功的pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質(zhì)粒載體及陰性對照轉(zhuǎn)染293T 細胞包裝慢病毒顆粒，再感染HepG2 靶細胞，提取總RNA 和蛋白進行驗證沉默效率。Real-time PCR 結(jié)果顯示，HDAC2-shRNA 能有效的抑制HepG2 細胞中HDAC2 mRNA 的表達，其中HDAC2-shRNA1 對HDAC2 基因的抑制率高達82.09%，HDAC2-shRNA2 與 HDAC2-shRNA3 對HepG2 細胞 HDAC2 基因的抑制率分別是71.06%、81.25%，說明構(gòu)建的HDAC2-shRNA 重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)錄水平能有效的抑制HDAC2 基因的表達。Western blotting 結(jié)果顯示，感染72 h 后，構(gòu)建的HDAC2 shRNA 能有效地抑制HepG2 細胞中的HDAC2 蛋白表達，與空白對照、空載體對照及陰性shRNA 對照組比較，差異明顯，而空白對照、空載體對照及陰性shRNA 對照組之間表達差異不顯著，提示構(gòu)建的HDAC2-shRNA 能有效下調(diào)肝癌HepG2 細胞中HDAC2 蛋白的表達，進一步證明成功構(gòu)建HDAC2-shRNA 干擾載體，該研究為后續(xù)進行慢病毒包裝及HDAC2 在肝癌中的功能提供理想的研究平臺。

綜上所述，本實驗采用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了pLKO.1-HDAC2-shRNA 慢病毒載體，并證實了其在肝癌HepG2 細胞中對HDAC2 基因的干擾效果，提示其可有效地沉默肝癌HepG2 細胞中HDAC2 基因的表達，說明HDAC2-shRNA 基因靶點篩選構(gòu)建的特異性和有效性，該研究為后續(xù)進行HDAC2 在肝癌中的功能提供了良好的前期實驗基礎(chǔ)。

［1］Wang SS，Li XM，Parra M，et al.Control of endothelial cell proliferation and migrationby VEGF signaling to histone deacetylase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008(22):7738－7743.

［2］Bracker TU，Sommer A，F(xiàn)ichtner I，et al.Efficacy of MS-275，a selective inhibitor of class I histone deacetylases，in human colon cancer models.Int J Oncol，2009(35):909－920.

［3］Weichert W.HDAC expression and clinical prognosis in human malignancies［J］.Cancer Lett，2009(2):168－176.

［4］Adams H，F(xiàn)ritzsche FR，Dirnhofer S，et al.Class I histone deacetylases 1，2 and 3 are highly expressed in classical Hodgkin’s lymphoma［J］.Expert Opin Ther Targets，2010(6):577－584.

［5］Fritsche P，Seidler B，Schuler S，et al.HDAC2 mediates therapeutic resistance of pancreatic cancer cells via the BH3-only protein NOXA［J］.Gut，2009(10):1399－1409.

［6］Kouzarides T.Histone acetylases and deacetylases in cell proliferation［J］.Curr Opin Genet Dev，1999(1):40－48.

［7］管曉翔，陳龍邦.組蛋白乙?；揎椩诨虮磉_調(diào)控中的作用機制［J］.中華腫瘤防治雜志，2007(4):307－310.

［8］Yamaguchi T，Cubizolles F，Zhang Y，et al.Histone deacetyIases 1 and 2 act in concert to promote the G1-to-S progression［J］.Genes Dev，2010(5):455－469.

［9］Huang BH，Laban M，Leung CH，et al..Inhibition of histone deacetylase 2 increases apoptosis and p21 CIP1/WAF1 expression.independent of histone deacetylase 1［J］.Cell Death Differ，2015(4):395－404.

［10］Hrzenjak A，Moinfar F，Kremser ML，et al.Valproate inhibition of histone deacetylase 2 affects differentiation and decreases proliferation of endometrial stromal sarcoma cell［J］.Mol Cancer Ther，2006(9):2203－2210.

［11］Witt O，Deubzer HE，Milde T，et al.HDAC family:What are the cancer relevant targets［J］.Cancer Lett，2009(1):8－21.

［12］Elbashir SM，Harborth J，Lendeekel WY，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interferenee in cultured mammalian cells［J］.Nature，2001(1):494－498.

［13］Hannon G J.RNA interference［J］.Nature，2002(6894):244－251.