陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科（西安710068）

陳 麗 郭興志 種 莉 任雪芝 劉 玥 劉 鵬 唐 鵬 李曉青 李 銳△

過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)變性疾病關(guān)系密切，前期研究表明：綠茶的一種多酚類單體－表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）具有強(qiáng)大的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化效應(yīng)［1］。神經(jīng)變性疾病是危害中老年人群的疾病，包括阿爾茨海默病及帕金森病等，隨著人們對(duì)神經(jīng)變性疾病認(rèn)識(shí)加深，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化釋放炎癥因子在神經(jīng)變性疾病的各個(gè)環(huán)節(jié)備受關(guān)注［2］。有研究顯示：在阿爾茨海默病患者的腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與β淀粉樣蛋白的沉積相隨［3］。Daisuke等研究表明：67KDa層粘連蛋白（67KDa laminin receptor，67LR）存在于腫瘤細(xì)胞膜表面且EGCG作為一種抗癌藥物可抑制67LR的活性［4］。本研究應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞雙標(biāo)染色及Western blot半定量觀察小膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在67LR，以及給予干預(yù)后67LR的表達(dá)量的變化，旨在為神經(jīng)變性疾病提供新的思路。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 24～48h的Spraque Dawley（SD）新生大鼠由西安交通大學(xué)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；低糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶，0.25% ／0.02%EDTA胰酶，購于 HyClone公司；小鼠抗大鼠CD11b抗體購于Millipore公司；兔抗大鼠67LR抗體購于Abcam公司；山羊抗小鼠熒光二抗（PE），山羊抗兔熒光二抗（FITC），山羊抗兔（HRP）二抗，B－actin內(nèi)參購于北京博奧森公司，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、EGCG購自美國Sigma公司；山羊封閉血清購于Sigma公司；DAB顯色液購于博奧森公司。預(yù)染蛋白Mark，BCA蛋白定量盒，蛋白裂解液RIPA，蛋白酶抑制劑均購于碧云天公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 神經(jīng)細(xì)胞－小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)，LPS刺激觀察細(xì)胞變化：SD大鼠，剪碎大腦皮質(zhì)后胰酶消化，接種于培養(yǎng)瓶中，加入10%胎牛血清及DMEM，培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞完全匯合后，分為對(duì)照組，LPS組，EGCG＋LPS組，24h后使用溫和消化法［5］分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，特異性抗體CD11b鑒定細(xì)胞純度，分別進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞雙標(biāo)及 Western blot。

2.2 免疫熒光細(xì)胞雙標(biāo)證明67LR存在小膠質(zhì)細(xì)胞上，并觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及67LR表達(dá)的變化：分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定30min，用山羊血清封閉液進(jìn)行封閉，加入特異性抗體CD11b，特異性抗體67LR，4℃冰箱過夜，加入熒光二抗PE和熒光二抗FITC，室溫下40min，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)學(xué)改變及67LR的表達(dá)。

2.3 Western blot半定量觀察67LR的表達(dá)量的變化：將培養(yǎng)分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取膜蛋白，BCA蛋白定量法定量蛋白濃度，加入40μg上樣，加緩沖液電泳。轉(zhuǎn)膜，在室溫下?lián)u床2h，加入67LR一抗，4℃冰箱過夜。加入HRP二抗。孵育1h后DAB顯色，用β－actin做內(nèi)參對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測(cè)定結(jié)果用圖像處理軟件，用SPSS17.0分析處理。

結(jié) 果

1 LPS刺激對(duì)混合培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響每瓶（75cm2）神經(jīng)元／小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)可得到（4.05±0.30）×106個(gè)細(xì)胞；而LPS刺激后可獲得（16±0.15）×106個(gè)細(xì)胞，為前者的3.95倍。

2 小膠質(zhì)細(xì)胞67LR不同狀態(tài)的變化 見附圖。在靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，CD11b、67LR、CD11b／67LR雙標(biāo)顯示細(xì)胞胞體細(xì)小且呈分枝狀、67LR的表達(dá)較少；給予LPS刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較靜息時(shí)明顯增多，雙標(biāo)顯示細(xì)胞胞體變大，呈阿米巴樣，67LR的總量增加，提示LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多，形態(tài)改變；另一組提前半小時(shí)給予EGCG干預(yù)后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞體呈分枝狀，67LR的總量減少，提示EGCG有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用。

3 小膠質(zhì)細(xì)胞67LR表達(dá)變化的免疫印跡分析Western blot半定量觀察小膠質(zhì)細(xì)胞上的67LR的表達(dá)量的變化，67LR行密度掃描半定量分析顯示：給予LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞67LR是β－actin1.8±0.52倍；提前加入0.5μM EGCG后67LR的表達(dá)是β－actin1.25±0.5倍；加入5μM EGCG后67LR的表達(dá)是β－actin的0.91倍，提示EGCG對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上的67LR具有抑制作用。

討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞約占膠質(zhì)細(xì)胞的10%左右，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，小膠質(zhì)細(xì)胞的存在方式有靜息和活化兩種狀態(tài)，并且易受微環(huán)境影響而從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為活化狀態(tài)，這是小膠質(zhì)細(xì)胞的特性之一［6］。在正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀或桿狀，對(duì)神經(jīng)元起著重要的支持、修復(fù)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)中扮演重要角色［7］。而當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受感染、外傷等，靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，形態(tài)發(fā)生改變，表面的突起，增粗，由分枝狀的轉(zhuǎn)變成阿米巴樣巨噬細(xì)胞，同時(shí)釋放各種炎癥因子，并出現(xiàn)增殖、趨化吞噬等功能［8］。Aβ沉積是AD神經(jīng)炎性老年斑的重要病理特征，如前所述在阿爾茨海默病患者的腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與β淀粉樣蛋白的沉積相隨［3］，因此小膠質(zhì)細(xì)胞在AD的病理改變具有極其重要的地位，所以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，減少炎性因子的釋放，成為改善AD發(fā)生的新策略。67LR已經(jīng)被證明存在于許多種腫瘤細(xì)胞膜上。有研究顯示：小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元混合培養(yǎng)，加入外源性層粘連蛋白（LPS）后激活小膠質(zhì)細(xì)胞的同時(shí)還可損傷神經(jīng)元，提示67LR對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡具有重要意義［9，10］。前期研究表明：EGCG對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化反應(yīng)有直接的抑制作用［1］，本實(shí)驗(yàn)通神經(jīng)細(xì)胞－小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察靜息狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，給予LPS這一強(qiáng)大的小膠質(zhì)細(xì)胞活化劑，小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息變?yōu)榛罨癄顟B(tài)后數(shù)量及形態(tài)變化，通過特異性抗體67LR免疫熒光標(biāo)記確證小膠質(zhì)細(xì)胞膜上存在67LR及67LR的表達(dá)增加，給予EGCG干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量及67LR的表達(dá)減少，進(jìn)一步用Western blot半定量觀察67LR的表達(dá)量的變化，提示67LR在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化中扮演重要角色，可能介導(dǎo)了EGCG的藥理學(xué)作用。本研究結(jié)果為神經(jīng)變性疾病治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

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