高　陽，劉　斌，哈尼再爾·熱合曼，李轉運，孫　湛(新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，基礎醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830054)

黑木耳多糖對內毒素誘導急性肺損傷大鼠肺組織的保護作用*

高陽1，劉斌1，哈尼再爾·熱合曼1，李轉運1，孫湛2△
(新疆醫(yī)科大學1臨床醫(yī)學院，2基礎醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830054)

［摘要］目的:探討黑木耳多糖對LPS誘導急性肺損傷大鼠肺組織的保護作用及其機制。方法:將健康SD大鼠隨機分為對照組、LPS組、地塞米松組以及黑木耳多糖低、中、高濃度組，根據(jù)分組，分別給予生理鹽水或不同濃度黑木耳多糖預防性灌胃7 d，第8天腹腔注射生理鹽水或LPS(8 mg/kg)，地塞米松組在給予LPS后腹腔注射地塞米松(3 mg/kg)。造模12 h后于腹主動脈取血，并制肺組織勻漿和肺泡灌洗液。檢測支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量、肺濕/干重比、髓過氧化物酶(MPO)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)等指標，做組織切片HE染色并進行肺損傷評分。結果:應用黑木耳多糖干預后，急性肺損傷大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量明顯下降，肺濕/干重比值降低;大鼠肺組織中MPO、NOS活性及MDA含量較LPS組降低，T-AOC含量和T-SOD活性較之升高;肺組織病理改變減輕，肺損傷指數(shù)下降。結論:黑木耳多糖具有保護LPS損傷大鼠肺組織的作用，其機制可能與其抗氧化作用有關。

［關鍵詞］黑木耳多糖;脂多糖;急性肺損傷;抗氧化作用

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由各種肺內外致病因素導致的以頑固性低氧血癥和呼吸窘迫為特征的全身炎癥反應綜合征，以大量中性粒細胞浸潤，微血管和肺泡上皮廣泛損傷，肺水腫及肺出血為病理特征，是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期階段。ALI的治療目前主要是保護性通氣等支持性治療［1］，尚未找到特效治療措施，死亡率高達40%，尋找有效的方法降低ALI患者的死亡率是臨床上迫切需要解決的問題。內毒素即脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的成分，是引起膿毒癥肺損傷的主要致病因子。采用內毒素注射復制急性內毒素性ALI動物模型是科研工作中的常用手段之一。在急性內毒素性ALI發(fā)展過程中，氧自由基釋放可產生脂質過氧化損傷，破壞細胞膜性結構，增加肺泡上皮細胞及肺泡毛細血管內皮細胞的通透性，促進ALI的發(fā)展。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖(Auricularia auricular-judae polysaccharide，AAP)有抗炎［2］、提高免疫力［3］等功能。在我們先前的研究中發(fā)現(xiàn)，其對膿毒血癥大鼠肝功能有保護作用［4］，在急性腎衰竭發(fā)病過程中也有一定保護作用［5］。另外，在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖能減輕大鼠心肌細胞過氧化損傷［6］。本研究旨在探討黑木耳多糖對LPS誘導急性肺損傷時對肺臟的保護作用，并探討其可能機制。

材料和方法

1實驗動物和主要試劑

健康雄性SD大鼠72只，雌雄不限，體質量200～220 g，購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

LPS(E.coli O55∶B5)購自Sigma;髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)試劑盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;地塞米松磷酸鈉注射液購自湖北潛江制藥股份有限公司;東北黑木耳購自廈門嘉祺生物食品有限公司，生產許可證號QS350216010315。

2方法

2.1黑木耳多糖的提取與純化采用熱水浸提法抽提黑木耳中的水溶性多糖: 300 g黑木耳，40倍蒸餾水浸泡30 min，90℃熱水浸提3.5 h，重復抽提3次，蒸發(fā)濃縮至300 mL，即黑木耳多糖濃度為1%。2.2動物分組及ALI模型建立將雄性SD大鼠隨機分為對照組、LPS組、地塞米松組及黑木耳多糖低、中、高組，每組12只。對照組、LPS組和地塞米松組使用生理鹽水灌胃，黑木耳多糖低、中、高組分別使用50 mg/kg、75 mg/kg和100 mg/kg純化黑木耳多糖灌胃，每天2次，連續(xù)7 d，劑量為10 mL/kg。第8天，經腹腔注射生理鹽水或LPS(8 mg/kg)，地塞米松組注射LPS 3 h后，經腹腔給予地塞米松(3 mg/kg)。

2.3肺濕/干重比值(W/D)測定各組小鼠腹腔注射生理鹽水或LPS后12 h，留取右肺上葉，用濾紙吸凈表面血液，稱肺濕重(wet，W)后將肺組織置于80℃烤箱內烘烤72 h至組織完全脫水，稱肺干重(dry，D)，計算肺W/D值，以評價肺組織的水腫程度。

2.4支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的蛋白測定打開胸腔，用止血鉗夾閉右側主支氣管，在氣管上段部分剪斷，插入16號針頭，用4℃的PBS進行左肺灌洗，每次1 mL，反復灌洗2次后抽出，共3次。灌洗液經3 000 r/min離心10 min，留取上清液檢測蛋白含量。

2.5肺組織中MDA含量、T-AOC及MPO、NOS、TSOD活性的測定SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法) ; T-AOC及MPO、NOS活性測定采用化學比色法; MDA含量測定采用TBA比色法。腹腔注射NS或LPS后12 h，立即處死大鼠取右肺中葉勻漿，測定肺組織中MDA含量、T-AOC及MPO、NOS、T-SOD活性，具體操作按南京建成生物工程研究所試劑盒操作說明進行。

2.6肺組織病理學檢查取右肺下葉做病理切片，分別置于10%甲醛液中固定、石蠟包埋，制作HE染色切片。光鏡下觀察其病理改變，按Mikawa等［7］方法進行肺損傷評分。評分標準如下:對肺泡充血，出血，肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項指標，分別依照病變輕重評0～4分(0:無病變或非常輕微; 1:輕度病變; 2:中度病變; 3:重度病變; 4:極重度病變)。各項評定分數(shù)相加為肺損傷總評分。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，不同處理組間的兩兩比較行SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1各組大鼠肺組織BALF蛋白含量和肺濕/干重比值

LPS組、黑木耳多糖低、中、高劑量組及地塞米松組的BALF蛋白水平和肺濕/干重比值均高于對照組(P＜0.05) ;黑木耳多糖低、中、高劑量組及地塞米松組的BALF蛋白水平較LPS組降低，但差異沒有統(tǒng)計學意義;黑木耳多糖中劑量組、高劑量組及地塞米松組的肺濕/干重比值明顯低于LPS組(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The protein concentration in BALF and lung W/D ratio of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖1不同處理對大鼠肺組織BALF蛋白含量和肺濕/干重比值的影響

2肺組織損傷評分

光鏡下觀察可見對照組肺組織結構完整，無出血、水腫; LPS組可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁結構破壞、肺間質水腫、肺泡腔和間質可見大量紅細胞，肉眼見片狀出血灶;與LPS組相比，黑木耳多糖各濃度組肺泡結構損傷輕微，間質水腫、炎性細胞浸潤和出血等情況均顯著減輕。LPS組肺組織損傷評分較正常組明顯增加，而黑木耳多糖預處理各濃度組的肺損傷程度明顯減輕，損傷評分下降，與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.HE staining of the rat lung tissue and the lung injury scores in different groups (×400).Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖2各組大鼠肺組織HE染色及肺組織的損傷評分

3黑木耳多糖對大鼠肺組織T-SOD活性、T-AOC 和MDA含量的影響

LPS組、黑木耳多糖低、中、高劑量組大鼠肺組織中的T-SOD活性較對照組降低，黑木耳多糖高劑量組、地塞米松組大鼠肺組織中T-SOD活性較LPS組明顯升高(P＜0.05)。LPS組、黑木耳多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中的T-AOC均低于對照組，黑木耳多糖高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中的T-AOC低于LPS組(P＜0.05)。LPS組、黑木耳多糖低、中劑量組大鼠肺組織中的MDA含量較對照組升高，黑木耳多糖中劑量組、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中的MDA含量較LPS組降低(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The level of the T-SOD activity，T-AOC and MDA content of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖3不同處理對大鼠肺組織T-SOD活性、T-AOC及MDA含量的影響

4黑木耳多糖對大鼠肺組織MPO和NOS活性的影響

LPS組、黑木耳多糖低劑量組大鼠肺組織中的MPO活性較對照組升高，黑木耳多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中的MPO活性較LPS組降低(P＜0.05) ; LPS組、黑木耳多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織中的NOS活性均高于對照組，黑木耳多糖低、中、高劑量組及地塞米松組的NOS活性較LPS組明顯降低(P＜0.05)，見圖4。

討論

肺是內毒素血癥的易損器官之一，內毒素入血及繼發(fā)產生的大量炎癥細胞因子，可很快引起肺內中性粒細胞的聚集和激活，造成肺的損傷。肺受損傷之后大量釋放炎癥細胞因子，除加重肺自身損傷外，也加重全身炎癥反應，導致全身臟器的損傷［8］。內毒素性肺損傷時，機體炎癥介質失衡，同時產生大量的氧自由基，引起脂質過氧化，直接導致組織損傷。本研究中，LPS組大鼠肺組織中可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁結構破壞、肺間質水腫、肺泡腔和間質可見大量紅細胞，肉眼見片狀出血灶;而黑木耳多糖能減輕上述病理損害。LPS可引起B(yǎng)ALF中的蛋白含量和肺組織濕/干重比值增加，而黑木耳多糖干預組后各組大鼠BALF中的蛋白含量和肺組織W/D明顯低于LPS組，提示黑木耳多糖可以減輕由LPS引起的急性肺損傷。

Figure 4.The levels of the MPO and NOS activity of the rats with different treatments.Mean±SD.n=12.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖4不同處理對大鼠肺組織MPO和NOS活性的影響

組織的MDA水平反映組織脂質過氧化程度，抑制脂質過氧化可顯著減輕內毒素誘導的肺損傷［9-10］。SOD是機體中主要的抗氧化酶，其通過清除機體細胞內自由基來保護細胞免受氧化應激損傷［11］，所以SOD活性是衡量機體抗氧化能力的重要指標。TAOC氧化防御體系由酶促和非酶促組成，T-AOC測定能客觀反映機體內抗氧化酶類的濃度，代表了生物體總抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組大鼠肺組織中的MDA含量明顯增加，而SOD活性和T-AOC明顯降低，給予黑木耳多糖的各組大鼠肺組織中MDA含量較LPS組明顯下降，SOD活性和T-AOC較LPS組大鼠明顯升高，提示黑木耳多糖能減輕由LPS引起的肺臟氧化損傷，且隨著黑木耳多糖濃度增加，這種抗氧化損傷的作用也逐漸增強。

MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的一種重要的過氧化物酶，既可以定量測定中性粒細胞的數(shù)目以反映中性粒細胞的浸潤情況，又可定量反映炎癥損傷的程度。研究中發(fā)現(xiàn)LPS能顯著增加肺組織中的MPO活性，而黑木耳多糖能有效降低肺組織中的MPO濃度，且隨著黑木耳多糖濃度增加，該作用逐漸增強。體內炎癥因子激活誘導型一氧化氮合酶，產生大量的NO。NO為一種自由基氣體，是一種生理和病理介質。正常情況下，NO起著宿主防疫作用，但過量的NO可導致各種慢性炎癥。黑木耳多糖干預組NOS活性顯著低于LPS組，提示黑木耳多糖能減輕機體的炎癥反應。

綜上所述，黑木耳多糖能減輕LPS引起的急性肺損傷，其作用可能與清除氧自由基及炎癥因子，減輕氧化應激反應有關。

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(責任編輯:盧萍，羅森)

Protective effect of Auricularia auricular-judae polysaccharide on pulmonary tissues of rats with LPS-induced acute lung injury

GAO Yang1，LIU Bin1，Hanizaier REHEMAN1，LI Zhuan-yun1，SUN Zhan2
(1Clinical College，2Preclinical Medical College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China.E-mail: sunzhan724@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of Auricularia auricular-judae polysaccharide (AAP) on pulmonary tissues of rats with LPS-induced acute lung injury (ALI) and its mechanisms.METHODS: Adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，LPS group，low-dose AAP group，middle-dose AAP group，high-dose APP group，and dexamethasone group.The rats were injected with LPS (8 mg/kg，ip) to induce ALI.The rats in the AAP groups were treated with AAP for 7 d before the induction of ALI.The protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was measured.The lung edema degree was measured by detecting the wet/dry weight ratio.The myeloperoxidase (MPO)，total antioxidant capacity (T-AOC)，total superoxide dismutase (T-SOD)，nitric oxide synthase (NOS) and malondialdehyde (MDA) levels were determined.The pathological changes of the lung tissues were evaluated by HE staining.RESULTS: Treatment with AAP significantly improved LPS-induced lung pathological changes，attenuated the protein concentration in the BALF and wet/dry weight ratio，inhibited the activities of MPO and NOS，reduced MDA level and increased the activities of T-AOC and T-SOD.CONCLUSION: AAP protects against LPS-induced acute lung injury in rats.

［KEY WORDS］Auricularia auricular-judae polysaccharides; Lipopolysaccharides; Acute lung injury; Antioxidation

通訊作者△Tel: 0991-4360915; E-mail: sunzhan724@126.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81260454) ;新疆維吾爾自治區(qū)大學生創(chuàng)新實驗項目(No.CX2014021)

［收稿日期］2015-04-29［修回日期］2015-07-20

［文章編號］1000-4718(2015)09-1704-06

［中圖分類號］R363.1

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.031