岳永花+何盼+孫迎娜+白關(guān)亞+郝旭亮+倪艷

[摘要]為篩選青翹抗炎的活性部位，明確作用機(jī)制，該研究給予雄性SD大鼠青翹水煎液、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水層各部位提取物，連續(xù)15d，復(fù)制急性肺損傷炎癥模型，觀察肺組織切片結(jié)構(gòu)，測試肺泡灌洗液的IL-6，TNF-a，IL-1，IL-10的水平，收集血清，采用H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。結(jié)果顯示青翹乙酸乙酯部位抗急性肺損傷炎癥活性較好，能夠抑制炎癥因子IL-6，TNF-a，IL-1的釋放，明顯降低血清中肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺的含量，升高GPC的含量。該研究從體內(nèi)代謝的角度進(jìn)一步證明了乙酸乙酯部位是青翹抗炎的主要活性部位，主要通過調(diào)節(jié)肌酸代謝、膽堿代謝、支鏈氨基酸代謝以及三羧酸循環(huán)等通路發(fā)揮抗炎作用，可為青翹抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]青翹；急性肺損傷；抗炎；活性部位；代謝組學(xué)

連翹系木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實(shí)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功效，大量研究證明連翹具有明顯的抗炎作用，按照采收時(shí)間的不同，通常將連翹分為青翹和老翹，2015年版《中國藥典》規(guī)定，青翹為秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干而成；老翹則為果實(shí)熟透時(shí)采收，曬干，除去雜質(zhì)而成。本課題組前期對(duì)青翹和老翹的藥理作用進(jìn)行了系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)青翹的抗炎作用優(yōu)于老翹。

炎癥模型根據(jù)發(fā)病原因可分為感染性炎癥、非特異性炎癥（包括小鼠耳腫脹、大鼠足跖腫脹、肉芽腫模型等）及變態(tài)反應(yīng)性炎癥。內(nèi)毒素（即脂多糖LPS）通過吸入方式進(jìn)入機(jī)體后誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而損傷肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺泡.毛細(xì)血管屏障通透性增加，最終造成感染后的急性肺損傷模型。曾有研究基于LPS誘導(dǎo)的人呼吸道上皮細(xì)胞炎癥模型對(duì)連翹提取物抗炎活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明90%連翹酯苷A為連翹提取物抗炎的主要活性部位，活性成分為連翹酯苷A，從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了連翹對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的抗炎作用，但其在體內(nèi)的抗炎活性部位及其作用機(jī)制尚無相關(guān)研究。

代謝組學(xué)是利用現(xiàn)代分析技術(shù)（如LC-MS，GC-MS，NMR）定量測定生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，考察生物體在不同狀態(tài)（生理和病理）下代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，能反映機(jī)體調(diào)控過程的終點(diǎn)，從而表征特定環(huán)境下生物體的整體功能狀態(tài)，具有整體性、動(dòng)態(tài)性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于中藥活性部位、活性成分的篩選及藥物作用機(jī)制等研究。本研究通過復(fù)制急性肺損傷炎癥模型，從病理形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥因子等傳統(tǒng)藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)青翹抗炎的活性部位進(jìn)行篩選，并闡明作用機(jī)制，為連翹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

1.1儀器

BioTek Synergy H1全功能微孔板檢測儀（美國BioTek公司）；JWC-201D超聲霧化器（鞍山市同信醫(yī)用儀器廠）；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Bruker 600 MHzAvanceⅢNMR Spectrometer（德國Bruker公司，600M核磁儀，600.13 MHz質(zhì)子頻率）；SIGMA 1-14高速離心機(jī)；石蠟包埋機(jī)（Histocentre 3，英國Shan.don）；石蠟切片機(jī)（Finesse 325，英國Shandon）；全自動(dòng)組織脫水機(jī)（Excelsior，英國Shandon）；熒光顯微成像系統(tǒng)（BX53，日本Olympus公司）。

1.2藥品與試劑

內(nèi)毒素（solarbio，批號(hào)818E035）；ELISA（IL-6，TNF-a，IL-1，IL-10）試劑盒（武漢博士德生物，批號(hào)EK0393）；正丁醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；石油醚30～60℃（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）；重水（D：O，Sigma-aldrich，USA）。青翹飲片（山西產(chǎn)，批號(hào)20140703）購自亳州成源中藥飲片有限公司，經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑所倪艷教授鑒定為青翹果實(shí)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）201343005，合格證號(hào)11804800001547。

1.4藥物制備

取青翹飲片1kg，加10倍量水浸泡1h，煎煮1h，濾出藥液，藥渣加8倍量水煎煮30min，重復(fù)1次，合并3次藥液，并減壓濃縮至1.0 g·mL^-1。將濃縮至1.0g·mL^-1的青翹水煎液按1：1依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，分出上層，合并各部位，回收溶劑，減壓干燥，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及剩余水層的浸膏。由于石油醚萃取部位的浸膏量較小，因此未進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將青翹水煎液和各部位提取物，按生藥量4 g·kg^-1。（臨床劑量的16倍）進(jìn)行換算，加0.5%吐溫80制成混懸液。

2方法

2.1模型復(fù)制及給藥方法

健康SD大鼠60只，隨機(jī)分為空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯組、正丁醇組和水層組，每組10只。青翹水煎液組、乙酸乙酯組、正丁醇組和水層組分別灌服生藥量4 g·kg^-1的相應(yīng)溶液，空白組和模型組大鼠灌服等量的生理鹽水，連續(xù)15d。末次給藥后，除空白組外，每組大鼠分別置于20mL20%內(nèi)毒素溶液經(jīng)超聲波霧化器霧化的內(nèi)毒素氣體中30 mint。

2.2樣本收集及指標(biāo)檢測

造模后4 h，20%烏拉坦麻醉后心臟取血，放置1 h，3 500 r·min。離心20min，取上清液，并分裝，于一80℃保存，備用。結(jié)扎右肺中葉后于頸部正中切開暴露氣管，并將氣管上端結(jié)扎，插入磨圓的注射器針頭，用5 mL生理鹽水灌洗，通過氣管插管慢慢注入氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸幾次，將洗液抽出，重復(fù)3次，最后得到2.5 mL洗液。將洗液放置1h后，3500r·min^-1離心20min，收集上清液。用ELISA試劑盒測定肺洗液中IL-6，TNF-a，IL-1和IL-10的含量，結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以x±s表示。取結(jié)扎的右肺中葉部位，固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，HE染色，做病理學(xué)檢查。

2.3代謝組學(xué)分析

2.3.1樣本處理血清樣品解凍后，吸取450μL于1.5 mL EP管中，加入350μL D20，渦旋30s，離心（4℃，13 000 r·min^-1）20 min，取600μL上清液轉(zhuǎn)移至核磁管（直徑5 mm）中，待測。

2.3.2H-NMR測試條件

樣品在Bruker 600MHz AVANCEⅢNMR儀（Bruker 5 mm BBO探頭，600.13 MHz，298 K）測定。采用cpmgprld脈沖序列以衰減脂蛋白和蛋白質(zhì)的寬單峰；掃描次數(shù)為64，譜寬為12019.2 Hz，圖譜大小65 536數(shù)據(jù)點(diǎn)，脈沖時(shí)間14μs，傅里葉變換LB=0.3 Hz，弛豫時(shí)間1.0s。

2.3.3H-NMR圖譜處理采用MestReNova（vet.sion 6.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compost-ella，Spain）核磁圖譜處理軟件對(duì)所有H-NMR圖譜進(jìn)行相位、基線調(diào)整，以肌酸（6 3.04）為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行化學(xué)位移的校正，對(duì)6 0.60～5.60區(qū)域的譜圖進(jìn)行6 0.01等寬度分割，水峰6 4.60～5.16區(qū)域以及麻醉劑信號(hào)4.13～4.18，1.31～1.33區(qū)域切除，其余區(qū)段積分。

2.3.4數(shù)據(jù)處理采用SIMCA-P 11.0（Umetrics，瑞典）軟件對(duì)H-NMR采集處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)中心化和規(guī)格化后，進(jìn)行主成分分析（principal componentanalysis，PCA），結(jié)果以PCA score plot表示，其中1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本（即1個(gè)代謝組），進(jìn)一步用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA）優(yōu)化組間差異，以相應(yīng)的VIP（var.iable importance in projection）值來尋找差異成分，VIP越大，表明該積分區(qū)間對(duì)應(yīng)的化合物對(duì)分組貢獻(xiàn)越大。采用SPSS 16.0軟件中one-way ANOVA對(duì)差異代謝物進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1病理學(xué)結(jié)果

空白組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，腔內(nèi)無滲出液體或炎癥細(xì)胞，基本正常；模型組肺泡組織可見增寬，間隔內(nèi)炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)中至重度充血，灶性肺泡內(nèi)充滿大量的紅細(xì)胞，肺泡中至重度擴(kuò)張；乙酸乙酯組間質(zhì)輕度充血，輕度炎細(xì)胞浸潤，肺泡輕至中度擴(kuò)張；正丁醇組和水層組肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)充滿紅細(xì)胞，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，擴(kuò)張嚴(yán)重的肺泡相互融合形成大的肺泡；水煎液組間質(zhì)輕度增寬、充血，炎細(xì)胞輕度浸潤。因此，與空白組相比，青翹乙酸乙酯提取物組肺組織損傷最小，其次為水煎液組，見圖1。

3.2生化指標(biāo)檢測

與空白組相比，模型組肺洗液中IL-6，TNF-a，IL-1的含量顯著升高（P<0.01），表明模型復(fù)制成功；與模型組相比，乙酸乙酯組IL-6，TNF-a，IL-1的水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；正丁醇組只有TNF-a的含量明顯低于模型組；水煎液組TNF-a，IL-1的含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；剩余水層各指標(biāo)與模型組相比無顯著性變化。各組之間IL-10的含量無明顯差異，結(jié)果見表1，表明青翹乙酸乙酯組可以顯著抑制炎癥因子的釋放，抗炎作用明顯。

3.3H-NMR代謝組學(xué)分析

3.3.1大鼠血清H-NMR圖譜歸屬

給予青翹水煎液、乙酸乙酯、正丁醇提取物后大鼠血清核磁圖譜見圖2，根據(jù)化學(xué)位移、峰形、耦合常數(shù)，結(jié)合文獻(xiàn)[12.13]以及數(shù)據(jù)庫the human metabolome database（HMDB，http：//www.hmdb.ca/），biological magneticresonance data bank（BMRB，http：//www.bmrb.wisc.edu/）對(duì)圖譜進(jìn)行指認(rèn)，共鑒定24個(gè)化合物，包含氨基酸、有機(jī)酸、碳水化合物等，具體化學(xué)位移歸屬見表2。

3.3.2多元統(tǒng)計(jì)分析直觀分析圖譜，較難發(fā)現(xiàn)各組間差異，因此借助多元統(tǒng)計(jì)分析，全面對(duì)比圖譜。對(duì)空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯部位和正丁醇部位大鼠血清核磁圖譜進(jìn)行PLS-DA分析，評(píng)價(jià)PLS-DA模型常用排列實(shí)驗(yàn)判定有效性，2條回歸線斜率越大，左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的小于右端，且最右端的2個(gè)值差距較小，證明模型有效。5組樣本整體分布得分圖和模型驗(yàn)證見圖3，表明吸入內(nèi)毒素和給予青翹提取物后，大鼠血清內(nèi)源性代謝物發(fā)生了變化；空白組、水煎液組、乙酸乙酯部位與正丁醇組、模型組基本沿t軸分開，水煎液和乙酸乙酯部位對(duì)吸入內(nèi)毒素的炎癥模型大鼠有向空白組調(diào)節(jié)的趨勢，且乙酸乙酯組更接近空白組，而正丁醇部位作用不明顯，表明青翹乙酸乙酯部位的抗炎活性最佳，可能是該部位有效富集了青翹的抗炎活性成分。

模型組分別與空白組、各給藥組進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見圖4。空白組與模型組能明顯分開且模型驗(yàn)證成立，表明吸人內(nèi)毒素的急性肺損傷炎癥模型復(fù)制成功。青翹水煎液組、乙酸乙酯組與模型組對(duì)比，均能明顯分開且模型有效、可靠；而正丁醇組與模型組PLS-DA模型驗(yàn)證不成立，表明青翹水煎液組和乙酸乙酯組可以調(diào)節(jié)炎癥模型大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，發(fā)揮了抗炎作用。

模型組血清與空白組相比，以VIP值大于1確定了13個(gè)差異代謝物，肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、葡萄糖、異亮氨酸、谷氨酰胺和TMA0含量升高，而丙氨酸、丙酮酸、GPC和PC含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。差異代謝物在各組中的含量分布見圖5，與模型組相比，青翹水煎液組顯著調(diào)節(jié)6個(gè)代謝物，肌酸、丁酸、琥珀酸、葡萄糖和TMAO的含量降低，GPC含量升高（P<0.05）；乙酸乙酯組顯著調(diào)節(jié)B個(gè)代謝物，肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和谷氨酰胺的含量降低，GPC含量升高（P<0.05）；正丁醇組對(duì)差異代謝物的調(diào)節(jié)不顯著；各給藥組對(duì)丙氨酸、丙酮酸和PC含量的調(diào)節(jié)均無顯著性變化；進(jìn)一步證明了青翹乙酸乙酯部位具有明顯的抗炎作用。

4討論

國內(nèi)外研究表明內(nèi)毒素致急性肺損傷模型的特點(diǎn)為：血液、肺支氣管灌洗液中炎癥因子水平升高及相關(guān)酶活性發(fā)生變化；肺血管壁通透性升高；肺組織病理切片上會(huì)有輕度肺水腫的現(xiàn)象。LPS進(jìn)入血液與相應(yīng)受體結(jié)合激活單核.巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，誘發(fā)機(jī)體釋放各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可分為：①介導(dǎo)組織損傷的促炎細(xì)胞因子，如TNF-a，IL.6，IL-1等；②抗炎細(xì)胞因子，如IL-4，IL-10等。本研究主要考察了肺泡灌洗液中TNF-a，IL-6，IL-1和IL-10的水平，結(jié)果表明乙酸乙酯部位能夠明顯降低IL-6，TNF-a和IL-1/～的水平，水煎液組可以明顯降低TNF-a和IL-1，正丁醇部位僅能使TNF-a的水平明顯降低，剩余水層對(duì)各指標(biāo)的調(diào)節(jié)不明顯。各組之間IL-10的含量無明顯變化，模型組IL-6，TNF-a，IL-1和IL-10的含量高于空白組，說明內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷炎癥過程中促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)同時(shí)存在，青翹發(fā)揮抗炎作用主要是通過抑制促炎癥細(xì)胞因子的釋放。

本研究進(jìn)一步對(duì)空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯組和正丁醇組大鼠血清進(jìn)行核磁共振代謝組學(xué)分析，共指認(rèn)24個(gè)代謝物，通過模式識(shí)別尋找到13個(gè)差異代謝物。為了明確青翹減輕急性肺損傷炎癥所涉及的代謝通路，本研究參考KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)發(fā)現(xiàn)的差異代謝物進(jìn)行生物學(xué)意義闡釋。

肌酸作為一種營養(yǎng)增補(bǔ)劑，能輔助為肌肉和神經(jīng)供能，是由甘氨酸、精氨酸和甲硫氨酸合成，可以經(jīng)肝臟和腎臟自行合成，也可以從食物中攝取。有研究表明補(bǔ)充肌酸可以減輕慢性阻塞性肺病和囊性纖維化，但其卻能明顯加重過敏性肺病炎癥。本實(shí)驗(yàn)中吸入內(nèi)毒素炎癥模型組肌酸含量較高，而給藥后含量降低，表明青翹可以抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的過敏炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮減輕肺損傷炎癥作用。

甘油磷酸膽堿（GPC）是機(jī)體內(nèi)磷脂代謝的產(chǎn)物之一，也是重要的神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿的生物合成前體。GPC合成磷脂酰膽堿，后者為細(xì)胞膜的重要組成部分；神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿組成膽堿能抗炎通路（CAP），該通路激活后可以抑制LPS誘導(dǎo)的NF.KB信號(hào)途徑活化，從而使炎癥因子表達(dá)下降。本研究水煎液組和乙酸乙酯組的GPC含量高于模型組，提示青翹一方面能夠保護(hù)肺泡細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，另一方面可以促進(jìn)乙酰膽堿的釋放，激活CAP，抑制炎癥反應(yīng)。

纈氨酸、異亮氨酸為9種必需氨基酸中2種，屬于支鏈氨基酸，二者作為生糖氨基酸，通過轉(zhuǎn)氨基作用生成琥珀酰輔酶A，后者為三羧酸循環(huán)（TCA）中很重要的一個(gè)酶，其在琥珀酸硫激酶的作用下生成琥珀酸。Nature雜志上已有研究報(bào)道，LPS增加了TCA循環(huán)中琥珀酸的水平，琥珀酸是先天免疫信號(hào)的代謝物，在炎癥發(fā)生時(shí)可以通過轉(zhuǎn)錄因子HIF-1提高IL-1的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)中模型組纈氨酸、異亮氨酸含量較高，引起葡萄糖和琥珀酸水平也相對(duì)較高。青翹水煎液和乙酸乙酯提取物能顯著降低琥珀酸含量，使IL-1的表達(dá)減少，從而抑制炎癥發(fā)生。

谷氨酰胺體內(nèi)脫氨生成谷氨酸，后者在谷氨酸脫氫酶的作用下生成酮戊二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成ATP，保證機(jī)體能量供給。谷氨酰胺已被報(bào)道可以抑制NF.KB活化，衰減炎癥細(xì)胞因子的釋放。本研究中谷氨酰胺含量給藥組低于模型組，可能是由于給藥組能量代謝高于模型組，使得其含量降低，具體原因還有待于進(jìn)一步分析。

氧化三甲胺（TMAO）的變化反映腸道菌群的紊亂，已有研究表明肺是一個(gè)重要的免疫器官，若肺部的炎性損傷未能及時(shí)控制，便可成為炎性介質(zhì)的發(fā)源地，加重全身性炎癥反應(yīng)。腸道菌群紊亂提示肺部炎癥連帶機(jī)體其他不良反應(yīng)的發(fā)生，青翹水煎液組的抗炎作用可以抑制腸道菌群紊亂。

青翹主要通過調(diào)節(jié)肌酸、甘油磷酸膽堿、琥珀酸和氧化三甲胺4個(gè)主要的生物標(biāo)志物來發(fā)揮抗炎作用，其余代謝物參與的通路有待進(jìn)一步分析。水煎液組可以顯著調(diào)節(jié)6個(gè)血清內(nèi)源性代謝物，參與的代謝通路有肌酸代謝、膽堿代謝、三羧酸循環(huán)以及腸道菌群代謝，而乙酸乙酯部位共調(diào)節(jié)8個(gè)，參與的代謝通路有肌酸代謝、膽堿代謝、支鏈氨基酸代謝以及三羧酸循環(huán)，二者調(diào)節(jié)的代謝物部分不同，說明作用靶點(diǎn)存在差異。本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)從機(jī)體內(nèi)源性代謝物整體變化的角度進(jìn)一步證明了乙酸乙酯部位是青翹抗炎的主要活性部位，并闡明了相應(yīng)的作用機(jī)制。