亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)iNOS抑制C57BL/6J小鼠動脈粥樣硬化的機(jī)制探討*

        2015-04-27 00:14:18林銳珊薛倩倩徐進(jìn)文閆福曼李小英劉海梅廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室西醫(yī)基礎(chǔ)公共實驗室廣東廣州50006
        中國病理生理雜志 2015年9期
        關(guān)鍵詞:動脈粥樣硬化一氧化氮白藜蘆醇

        秦 麗,關(guān) 莉,林銳珊,薛倩倩,徐進(jìn)文,閆福曼,李小英,劉海梅△(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,西醫(yī)基礎(chǔ)公共實驗室,廣東廣州50006)

        白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)iNOS抑制C57BL/6J小鼠動脈粥樣硬化的機(jī)制探討*

        秦麗1,關(guān)莉1,林銳珊2,薛倩倩1,徐進(jìn)文1,閆福曼1,李小英1,劉海梅1△
        (廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室,2西醫(yī)基礎(chǔ)公共實驗室,廣東廣州510006)

        [摘要]目的:探討白藜蘆醇(resveratrol,RES)對卵巢切除小鼠血脂四項總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及血清一氧化氮(nitric oxide,NO)含量、胸主動脈的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion,ONOO(-))及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白表達(dá)水平的影響。方法:雌性C57小鼠經(jīng)卵巢切除建立去勢模型后,分為假手術(shù)組、單純?nèi)萁M、假手術(shù)高脂組、模型高脂組和RES組。單純?nèi)萁M和假手術(shù)組給予普通飼料,其余給予高脂飼料。14周后,收集血清檢測各組血清的CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平,硝酸還原酶法測血漿NO水平,油紅O染色觀察動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)情況,DAB染色測定血管ONOO(-)及iNOS水平,免疫印跡測定血管組織的iNOS表達(dá)。結(jié)果:模型高脂組血清CHOL、TG、LDL-C和NO較正常對照組升高(P<0.05) ;與模型高脂組相比,RES組可降低小鼠血清的TC、TG、LDL-C和NO(P<0.05) ; 14周后,AS模型成功建立,模型高脂組有明顯的AS病理改變,單純?nèi)萁M無明顯AS斑塊,RES組AS病變明顯減輕;高脂喂養(yǎng)14周后,模型高脂組血管組織的iNOS及ONOO(–)表達(dá)也較正常對照組明顯提高(P<0.05) ;與模型高脂組相比,RES組可降低小鼠胸主動脈的iNOS表達(dá)(P<0.05),與此同時,血管ONOO(-)含量較模型高脂組降低。結(jié)論: RES可以抑制iNOS表達(dá),減少NO生成,防治動脈粥樣硬化。

        [關(guān)鍵詞]白藜蘆醇;動脈粥樣硬化;一氧化氮;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

        動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種炎癥性疾病,外源性因素如低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、高血壓、糖尿病、吸煙等引起的自由基增多,損害內(nèi)皮,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞黏附聚集、淋巴細(xì)胞激活等,在局部釋放血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子和促凝因子等,誘發(fā)炎性反應(yīng),并刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白合成增加,一氧化氮(nitric oxide,NO)分泌增多,進(jìn)一步加重AS。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(resveratrol,RES)具有潛在的抗AS作用,但其機(jī)制尚不明確,本研究用C57BL/6J小鼠建立卵巢切除模型,試圖闡明白藜蘆醇、iNOS、NO和AS之間的關(guān)系。

        材料和方法

        1實驗動物

        雌性C57BL/6J小鼠60只,體質(zhì)量18~22 g,購于廣東省實驗動物中心,合格證號為No.0004089。

        2藥物、試劑和主要儀器

        RES購自Aladdin; iNOS抗體和nitrotyrosine抗體購自Abcam; GAPDH抗體購自Sigma; SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司; DAB顯色試劑盒購自中杉金橋; NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

        冰凍切片機(jī)(Leica) ; Olympus顯微鏡和ImageJ圖像分析軟件;冰凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司) ;酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

        3方法

        3.1分組和制備去勢模型60只雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,隨機(jī)分為6組,即假手術(shù)(sham)組、假手術(shù)高脂(high fat,HF)組(sham+ HF組)、卵巢切除術(shù)(ovariectomy,OVX)組、模型高脂(OVX+ HF)組和RES組。OVX組、OVX+ HF組和RES組均手術(shù)去勢,摘除雙側(cè)卵巢[1]。手術(shù)前禁食12 h,以10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后,仰面固定,剔除下腹部長毛,用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)域,經(jīng)下腹部正中開一切口約2 cm,依次切開皮膚,皮下組織,腹白線等,找到子宮,之后沿著子宮末端找到卵巢,結(jié)扎后切除卵巢組織,并縫合皮下及皮膚層[2]。其余組進(jìn)行假手術(shù)操作,在切開腹壁后找到輸卵管切除部分脂肪后縫合。

        3.2分組和給藥腹腔術(shù)后正常飲食7 d后開始給藥。RES組: 10只小鼠,以15 g/L的RES 0.2 mL/d灌胃,高脂飲食; sham組和OVX組:等容積的生理鹽水灌胃,普通飲食; OVX+ HF組和sham+ HF組:等容積的生理鹽水灌胃,高脂飲食。干預(yù)14周。

        3.3血清的采集及血脂的測量實驗14周末禁食12 h,摘眼球取血約0.5~1 mL,靜置后離心分離血清,生化分析儀檢測血脂4項總膽固醇CHOL、三酰甘油TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C。

        3.4血漿中NO水平的檢測實驗14周末,采取眼球取血。將血樣本在3 000 r/min離心15 min,用硝酸還原酶法測定NO水平。

        3.5胸主動脈油紅染色實驗14周末取血后小鼠頸椎脫臼法處死,立即取出胸主動脈血管做常規(guī)冰凍切片,片厚10 μm,晾干存放在-80℃。用時各組取出1張切片,室溫晾干,配置好油紅工作液過濾,將配好的油紅滴加在組織上10 min,用濾紙吸干周邊的油紅,將切片放在60%的異丙醇中,待背景變無色后取出(顯微鏡下觀察),稍微晾干,滴加蘇木素溶液(顯微鏡下見細(xì)胞核變藍(lán)色) 3 min,立即將切片置于自來水,流水洗10 min,取出切片甘油明膠封片,顯微鏡拍片。

        3.6免疫組化檢測主動脈iNOS的表達(dá)胸主動脈經(jīng)常規(guī)固定、脫水、包埋,每例標(biāo)本均做厚度為10 μm的連續(xù)切片6~8張,進(jìn)行染色。iNOS的蛋白表達(dá)測定采用DAB染色,參照試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡觀察并拍照,ImageJ進(jìn)行半定量分析。

        3.7各組小鼠胸主動脈ONOO-檢測冰凍切片進(jìn)行DAB染色,使用nitrotyrosine抗體,過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡觀察并拍照,ImageJ進(jìn)行半定量分析。

        3.8Western blot檢測iNOS蛋白的表達(dá)RIPA法提取組織蛋白,以BCA法進(jìn)行蛋白定量,用10% SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,然后與iNOS和GAPDH相應(yīng)抗體4℃孵育過夜,次日以TBST洗膜,再用相應(yīng)的II抗(羊抗兔)室溫孵育1 h,洗膜后加化學(xué)發(fā)光劑暗室中曝光,膠片經(jīng)顯影和定影,蛋白帶用凝膠圖像分析儀分析和定量。

        4統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用S-N-K法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié)果

        1各組小鼠血脂水平的比較

        各組小鼠之間的CHOL、HDL和LDL水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義; OVX+ HF組除HDL-C較正常組降低外,CHOL、TG和LDL-C均較正常對照組升高(P<0.05) ;與OVX+ HF組相比,RES預(yù)處理后可明顯降低小鼠血清的CHOL、TG和LDL-C,升高HDL-C(P<0.05),見表1。

        表1 各組小鼠血脂水平的比較Table 1.The levels of blood lipids in different groups (mmol/L.Mean±SD.n=6)

        2各組小鼠血漿中的NO水平

        高脂喂養(yǎng)14周后,OVX+ HF組血清NO含量較sham組明顯升高(P<0.05),與OVX+ HF組相比,RES可有效降低血清的NO含量(P<0.05),見圖1。

        Figure 1.The effect of resveratrol on plasma NO content in different groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX+ HF group.圖1白藜蘆醇對C57卵巢去勢小鼠血漿NO水平的影響

        3各組油紅染色觀察

        高脂喂養(yǎng)14周后,sham組血管結(jié)構(gòu)清晰可見,內(nèi)膜連續(xù)完整而光滑; OVX+ HF組的內(nèi)膜有較明顯的脂質(zhì)斑塊,內(nèi)膜明顯增厚; RES組內(nèi)膜增厚程度均較輕,脂質(zhì)斑塊也明顯減少。半定量分析后可見RES組平均光密度值較OVX+ HF組明顯降低(P<0.05),見圖2。結(jié)果顯示RES對小鼠的AS斑塊的形成有抑制作用。

        4各組iNOS免疫組化染色觀察

        高脂喂養(yǎng)14周后,胸主動脈切片進(jìn)行DAB染色,結(jié)果顯示OVX+ HF組的iNOS表達(dá)相比sham組顯著增加,而RES組的iNOS表達(dá)量明顯低于OVX+ HF組。半定量分析結(jié)果顯示OVX+ HF組的平均吸光度顯著高于其它組,而RES組的平均吸光度則明顯降低(P<0.05),見圖3,說明RES能有效抑制血管內(nèi)皮iNOS的表達(dá),從而降低NO的生成。

        Figure 2.The structure and average absorbance of the aorta in C57BL/6J mice with Oil Red O staining (×20).Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX+ HF group.圖2油紅染色顯示C57BL/6J小鼠胸主動脈結(jié)構(gòu)和油紅染色的半定量分析

        Figure 3.The effect of resveratrol on expression of iNOS in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX+ HF group.圖3免疫組織化學(xué)染色分析主動脈iNOS的表達(dá)

        5胸主動脈ONOO-的檢測

        DAB染色圖像顯示OVX+ HF組的ONOO-含量顯著高于其它組,而RES組的ONOO-含量則較之大幅度減少。半定量分析顯示OVX+ HF組組的平均吸光度明顯高于其它組,而RES組的平均吸光度只有OVX+ HF組的1/2左右(P<0.05),見圖4,證明RES能有效地減少ONOO-。

        Figure 4.The ONOO-production in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX+ HF group.圖4血管ONOO-的DAB染色和半定量分析

        6各組小鼠血管的iNOS表達(dá)

        與對照組相比,OVX+ HF組的iNOS蛋白表達(dá)明顯增高,而RES灌胃后,可明顯降低iNOS在血管組織中的表達(dá)(P<0.05),提示RES能有效抑制iNOS在血管組織中的表達(dá),從而降低NO的合成,見圖5。

        討論

        AS是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病,是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)[3-4]。大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明,AS的危險因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖(糖尿病)、高纖維蛋白原血癥,肥胖、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活化、吸煙,NO等自體生物活性物質(zhì)代謝紊亂等因素[5-6]。到目前為止,AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,存在多種學(xué)說,涉及多種危險因素[7]。

        Figure 5.The effect of resveratrol on the protein expression of iNOS in the thoracic aorta of different groups.Mean± SD.n=4.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX+ HF group.圖5 Western blot檢測C57小鼠胸主動脈的iNOS表達(dá)

        AS發(fā)生、發(fā)展中,高脂血癥所造成的動脈內(nèi)皮功能損害起關(guān)鍵作用,這種損害可能的原因是內(nèi)皮細(xì)胞NO代謝的異常。NO廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中,是一種重要的生物活性分子。NOS能夠催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和NO,現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)的NOS類型包括神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS,nNOS)、iNOS和內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)。在動脈血管壁組織中與AS相關(guān)聯(lián)的主要是eNOS和iNOS。在正常生理狀態(tài)下,NO是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的eNOS催化產(chǎn)生的,血管中缺乏iNOS。但在某些炎癥介質(zhì)的刺激下,血管中的iNOS可能被誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)生大量的超出生理濃度的NO,這些過量的NO可能反而引起血管功能障礙,對機(jī)體造成損害[8]。因此,NO 在AS的發(fā)病中具有雙重作用[9]。大量NO與氧自由基可迅速反應(yīng)生成氧化活性更高的ONOO-,比NO對細(xì)胞具有更大的損傷性[10],從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成。我們的實驗結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組有明顯的高脂血癥,iNOS表達(dá)顯著升高,產(chǎn)生大量的NO,有明顯的斑塊形成。

        RES是一類目前尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用的植物雌激素,作用類似于雌激素,但更有優(yōu)勢及其潛力,主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄等植物中,具有一定的抗AS作用[11]。已有相關(guān)研究顯示RES可明顯降低高脂飲食大鼠血清的LDL、甘油三酯、膽固醇含量,降低動脈硬化指數(shù)[12]。邊寧等[13]報道高脂對照組大鼠血清iNOS表達(dá)顯著增加,產(chǎn)生大量NO,給予RES大鼠血清iNOS表達(dá)明顯減少,血脂顯著降低,說明RES可糾正高脂血癥大鼠NO代謝紊亂,從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,對抗AS的發(fā)生和發(fā)展。也有報道RES具有酚羥基結(jié)構(gòu),具有很強(qiáng)的自由基清除能力[14]。Olas等[15]研究顯示RES可明顯抑制高濃度的ONOO-血漿介導(dǎo)的氧化反應(yīng),我們的實驗結(jié)果也表明白藜蘆醇組ONOO-生成明顯降低,NO含量減少,也證實了這一觀點。

        [參考文獻(xiàn)]

        [1]梁秀蘭.SD大鼠絕經(jīng)模型的建立[J].醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(9) : 1414-1416.

        [2]王燁,徐蓮薇,朱芝玲.調(diào)更湯對圍絕經(jīng)期雌性大鼠生殖內(nèi)分泌影響的實驗研究[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(12) : 72-74.

        [3]Cai X,Li X,Li L,et al.Adiponectin reduces carotid atherosclerotic plaque formation in ApoE-/-mice: roles of oxidative and nitrosative stress and inducible nitric oxide synthase[J].Mol Med Rep,2015,11 (3) : 1715-1721.

        [4]O’Neal WT,Soliman EZ,Qureshi W,et al.Sustained pre-hypertensive blood pressure and incident atrial fibrillation: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis[J].J Am Soc Hypertens,2015,9(3) : 191-196.

        [5]Obuchowicz A,Kniazewska M,Zmudzińska-Kitczak J,et al.Concentrations of tumour necrosis factor-α and its soluble receptors in the serum of teenagers with atherosclerosis risk factors: obesity or obesity combined with hypertension[J].J Pediatr Endocrinol Metab,2014,27(11-12) : 1209-1212.

        [6]Wand CJ,Liu JT,Guo F,et al.Endothelin-1 induces the expression of C-reactive protein in vascular smooth muscle cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,389 (3) : 537-542.

        [7]劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報,2015,36(2) : 142-145.

        [8]Zhang X,Xiong H,LI H,et al.Effects of florlenicol on LPS-induced nitric oxide and prostaglandin E2production in RAW 264.7 macrophages[J].Fundam Clin Pharmacol,2011,25(5) : 591-598.

        [9]Li H,Horke S,F(xiàn)?rstermann U.Vascular oxidative stress,nitric oxide and atherosclerosis[J].Atherosclerosis,2014,237(1) : 208-219.

        [10]劉艷,吳偉康,楊成梯,等.從氧自由基、一氧化氮探討四逆湯抗急性失血性休克的肝臟機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2013,29(6) : 810-814.

        [11]He S,Yan X.From resveratrol to its derivatives: new sources of nature antioxidant[J].Curr Med Chem,2013,20(8) : 1005-1017.

        [12]趙克森.白藜蘆醇的生物學(xué)效應(yīng)和特性[J].中國病理生理雜志,2012,28(9) : 1709-1711.

        [13]邊寧,龔博君,郭軍,等.一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化過程中的作用[J].中國病理生理雜志,2014,30(3) : 414-418.

        [14]過華蕾,廖麗貞,陳燕玲,等.白藜蘆醇對抗D-半乳糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老及其機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2012,28(12) : 2141-2146.

        [15]Olas B,Nowak P,Kolodziejczyk J,et al.Protective effects of resveratrol against oxidative/nitrative modifications of plasm proteins and lipids exposed to peroxynitrite [J].J Nutr Biochem,2006,17(2) : 96-102.

        (責(zé)任編輯:林白霜,羅森)

        Resveratrol regulates iNOS to inhibit atherosclerosis in C57BL/6J mice

        QIN Li1,GUAN Li1,LIN Rui-shan2,XUE Qian-qian1,XU Jin-wen1,YAN Fu-man1,LI Xiao-ying1,LIU Hai-mei1
        (1Department of Physiology,2Western Medicine Basis Public Laboratory,Basic Medical College,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China.E-mail: lhmei99@163.com)

        [ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of resveratrol on the lipids (CHOL,TG,LDL-C and HDL-C),nitric oxide (NO),peroxynitrite anion (ONOO(-)) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the artery of the mice with ovariotomy (OVX).METHODS: The lipid levels and NO level in the serum were measured.The changes of atherosclerosis were evaluated with Oil Red O staining.The expression of iNOS was measured by DAB staining and Western blot.The ONOO(-)production was measured by DAB staining.RESULTS: Compared with sham group,the levels of the lipids and NO production in OVX+ high fat (HF) group were increased (P<0.05).Compared with OVX+ HF group,the levels of the lipids and NO production in resveratrol group were decreased (P<0.05).Fourteen weeks later,the atherosclerosis model was successfully established.Compared with OVX+ HF group,the iNOS expression and the ONOO(-)production in resveratrol group were decreased (P<0.05),while those in sham group were increased (P<0.05).CONCLUSION: Resveratrol prevents and treats atherosclerosis by inhibiting the iNOS expression in C57BL/6J mice.

        [KEY WORDS]Resveratrol; Atherosclerosis; Nitric oxide; Inducible nitric oxide synthase

        通訊作者△Tel: 020-39358028; E-mail: lhmei99@163.com

        *[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81202186)

        [收稿日期]2015-04-02[修回日期]2015-08-02

        [文章編號]1000-4718(2015)09-1601-05

        [中圖分類號]R363.1; R543

        [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

        doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.012

        猜你喜歡
        動脈粥樣硬化一氧化氮白藜蘆醇
        白藜蘆醇研究進(jìn)展
        云南化工(2021年11期)2022-01-12 06:06:12
        瑞舒伐他汀治療老年冠心病合并高脂血癥的臨床分析
        擴(kuò)大的血管周圍間隙與腦小血管病變關(guān)系的臨床研究
        短暫性腦缺血發(fā)作患者ABCD2評分與血漿同型半胱氨酸水平的關(guān)系
        一氧化氮在胃食管反流病發(fā)病機(jī)制中的作用
        山楂水煎液對高脂血癥大鼠早期動脈粥樣硬化形成過程的干預(yù)機(jī)制
        一氧化氮在小鼠囊胚發(fā)育和孵化中的調(diào)控作用
        一氧化氮在糖尿病神經(jīng)病變發(fā)病中的作用
        呼出氣一氧化氮檢測對支氣管哮喘的診斷意義
        白藜蘆醇抑菌作用及抑菌機(jī)制研究進(jìn)展
        中文亚洲成a人片在线观看| 久久久无码精品亚洲日韩按摩| 亚洲欧美激情在线一区| 国产精品理人伦国色天香一区二区| 国产美女三级视频网站| av网站免费在线浏览| 国产成人无码综合亚洲日韩| 欧美 日韩 国产 成人 在线观看| 北岛玲中文字幕人妻系列| 蜜桃码一区二区三区在线观看| 亚洲最大成人网站| 无码精品人妻一区二区三区人妻斩| 国产精品无码久久久一区蜜臀| 国产猛男猛女超爽免费av| 亚洲国产高清精品在线| 欧美人与物videos另类| 国产福利酱国产一区二区| 日韩性感av一区二区三区| 无码伊人66久久大杳蕉网站谷歌| 亚洲处破女av日韩精品| 婷婷综合缴情亚洲狠狠| 日本女u久久精品视频| 国产精品高清一区二区三区不卡| 国产剧情麻豆女教师在线观看| 色综合色综合久久综合频道| 99精品人妻少妇一区二区三区 | 18无码粉嫩小泬无套在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久久久| 亚洲午夜精品久久久久久人妖| 乱人伦人妻中文字幕无码| 中文字幕人妻被公喝醉在线| 少妇伦子伦情品无吗| 国产麻无矿码直接观看| 亚洲免费无毛av一区二区三区| 国产麻豆精品传媒av在线| 日韩欧美人妻一区二区三区| 亚洲制服无码一区二区三区| 久久精品有码中文字幕1| 日韩一区二区三区久久精品| 最新精品国偷自产在线| 国产精品爽爽va在线观看网站|