徐丹丹,陳顯化,金朝霞,張宗申,3*,張孟夏,王培忠

羊肚菌(Morchella esculenta)屬羊肚菌科羊肚菌屬,是珍貴食藥用真菌,因其外觀極似羊肚又稱“羊肚蘑”[1].羊肚菌營養(yǎng)豐富,含有多糖、氨基酸、脂肪酸、吡喃酮、抗生素類等[2],其中多糖是主要的活性成分,具有增強(qiáng)免疫力[3]、抗疲勞[4]、預(yù)防動脈硬化[5]、抑制腫瘤[6,7]等功效.由于羊肚菌生境特殊的原因,野生菌極少,再加上人工栽培極其困難,導(dǎo)致其市場供應(yīng)嚴(yán)重不足.繼1958年J.Sguest[8]首次在發(fā)酵罐中培養(yǎng)羊肚菌菌絲后,通過發(fā)酵技術(shù)高效培養(yǎng)羊肚菌及其活性物質(zhì),是解決羊肚菌資源短缺問題的手段之一.歐超等[9]對羊肚菌發(fā)酵過程中碳源、氮源、無機(jī)鹽及培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究.賈建會等[10]以深層發(fā)酵的羊肚菌菌絲和發(fā)酵液為主要原料進(jìn)行多糖提取,并對多糖進(jìn)行了純化及組分鑒定.魏蕓等[11]對羊肚菌多糖的分離純化及組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,為羊肚菌多糖的深入研究奠定了基礎(chǔ).

利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用多元方程擬合因素和響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系,經(jīng)回歸分析尋找最佳條件,是解決多變量的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)常用方法[12].本研究以天然谷物作為碳源和氮源,不添加任何化學(xué)試劑,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化羊肚菌液體發(fā)酵過程中菌絲體生物量和胞外多糖積累條件,為規(guī)?；a(chǎn)羊肚菌及其多糖提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌(Morchella esculenta),大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心保藏.

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將于4℃下保藏的菌種接種于PDA斜面上,25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 液體種子制備

挑取3個0.5 cm2的菌絲塊接入液體種子培養(yǎng)基中,在25℃和150 r/min下震蕩培養(yǎng)5 d.

1.2.3 種子培養(yǎng)基的制備

稱取葡萄糖2 g、蛋白胨1 g、MgSO40.1 g、KH2PO40.046 g、(NH4)2SO40.1 g,用水定容至100 m L,120℃、0.1 MPa滅菌30 min.

1.2.4 最佳培養(yǎng)基的確定

用玉米粉和黃豆粉配置三種比例的培養(yǎng)基分別為1號:玉米粉7.5 g+黃豆粉5 g;2號:玉米粉10 g+黃豆粉5 g;3號:玉米粉12.5 g+黃豆粉5 g.分別配制成100 m L培養(yǎng)基,分裝在250 m L錐形瓶中,經(jīng)120℃滅菌30 min.在滅菌后的培養(yǎng)基中接入10%的液體種子,于25℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d.

1.2.5 生長曲線的測定

在優(yōu)化培養(yǎng)條件下,每隔12 h測定一次菌絲體干重和胞外多糖濃度.以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),菌絲體生物量和胞外多糖濃度為縱坐標(biāo),繪制生長曲線.

1.2.6 菌絲體生物量的測定

發(fā)酵液過濾后,菌絲體用去離子水沖洗3次,然后用抽濾機(jī)抽干,于60℃烘箱中烘干至恒重,用分析天平稱重.

1.2.7 胞外多糖的測定

1.2.7.1 胞外多糖的提取與分離

去菌絲的發(fā)酵液于4000 r/min下離心20 min,取上清液,加入3倍體積95% 乙醇,調(diào)節(jié)p H至7.3,于4℃冰箱中靜置24 h,4000 r/min下離心30 min,棄去上清液[13].沉淀溶解于15 m L去離子水中,移入20 m L容量瓶中定容.取0.1 m L溶液用苯酚-硫酸法測定多糖含量.

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法參考Sawabe[14].獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.007x+0.027 3,R2=0.999 3.

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.002 4x-0.009 3,R2=0.997 4.

以上試驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次,取平均值.

1.2.8 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面分析法對羊肚菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Boxbenhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15],選取溫度、起始p H、搖床轉(zhuǎn)速三個因素,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1).

表1 響應(yīng)面因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 羊肚菌液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基的確定

由圖1可知,羊肚菌在1、2、3號培養(yǎng)基中均能較好地生長,說明玉米粉和黃豆粉能滿足羊肚菌生長的基本營養(yǎng)需要,但是在不同配比的培養(yǎng)基中,羊肚菌菌絲體的生長情況和胞外多糖濃度有所變化.其中以2號培養(yǎng)基中菌絲體生長量和胞外多糖濃度達(dá)到最大,菌絲球大小比較均勻且比較小,所以以2號培養(yǎng)基作為羊肚菌液體發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基.

圖1 羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度的影響

由圖2可知,溫度從21～25℃遞變時,羊肚菌的菌絲生物量和胞外多糖濃度顯著增加,溫度從25～31℃時,菌絲體生物量和胞外多糖濃度顯著下降,因此選擇25℃為發(fā)酵溫度.

圖2 發(fā)酵溫度對羊肚菌液體發(fā)酵的影響

2.2.2 培養(yǎng)基起始p H對羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度的影響

圖3結(jié)果表明,培養(yǎng)基p H為6時,羊肚菌的菌絲生物量和胞外多糖濃度達(dá)到最大,分別達(dá)到7 g/L和130 mg/L,故而選擇起始p H為6.

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度的影響

在160 r/min之前,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,羊肚菌菌絲生物量和胞外多糖濃度不斷增加.在160～200 r/min時,菌絲生物量和胞外多糖濃度隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大而降低(見圖4),所以選擇160 r/min作為羊肚菌液體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速.

圖3 起始p H對羊肚菌液體發(fā)酵的影響

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對羊肚菌液體發(fā)酵的影響

2.3 羊肚菌的生長曲線

羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度與培養(yǎng)時間的關(guān)系如圖5所示.羊肚菌生長周期為144 h,0～48 h為延滯期,48～120 h為旺盛生長期,此后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期.在培養(yǎng)144 h時菌絲體生物量和胞外多糖濃度達(dá)到頂峰,分別為7.75 g/L和131.7 mg/L.

圖5 羊肚菌液體發(fā)酵的生長曲線

2.4 響應(yīng)面法對羊肚菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken中心組試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,按中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),共進(jìn)行19組試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表2.

利用Design-Expert軟件,通過對羊肚菌菌絲體生物量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得菌絲體生物量對編碼自變量發(fā)酵溫度(A)、p H(B)及搖床轉(zhuǎn)速(C)的二次多項(xiàng)回歸方程:

菌絲體生物量=7.73+0.24A+0.20B-0.065C-5.000E-003AB+0.030AC+0.015BC-0.70A2-0.71B2-0.10C2

P＜0.001,表明試驗(yàn)所采用的二次模型是極顯著的,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的.本試驗(yàn)P為0.050 4＞0.05,對模型是有利的,無失擬因素存在,因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.模型中一次項(xiàng)A、B對菌絲體生物量的影響極顯著(P＜0.01);二次項(xiàng)A2、B2對菌絲體生物量的影響極顯著(P＜0.01);C2對菌絲體生物量的影響顯著(P＜0.05).表明試驗(yàn)因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系,因素間的交互作用對菌絲體生物量有影響.交互項(xiàng)AB、AC、BC的P均大于0.05,所以交互項(xiàng)對菌絲體生物量沒有顯著性影響.模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.990 7,即該模型能解釋99.07%的響應(yīng)值變化,說明該模型擬合程度良好,可以用此模型對菌絲體生物量進(jìn)行分析和預(yù)測.

表2 羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4.2 各因素間的交互作用

圖6～8是根據(jù)回歸方程,利用Design-Expert軟件做出的各個因子交互作用的響應(yīng)面的3D和等值線分析圖.經(jīng)軟件分析計(jì)算得到羊肚菌液體發(fā)酵的最佳條件:25.33℃、p H 6.13、154.33 r/min,預(yù)測值分別為:菌絲體生物量7.78 g/L、胞外多糖濃度130.97 mg/L.

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,以最佳發(fā)酵條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了5次驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果表明:菌絲體平均生物量為7.75 g/L、胞外多糖濃度為130.68 mg/L,與實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測值吻合,這表明該模型是合理有效的,且優(yōu)化的羊肚菌液體發(fā)酵條件具有實(shí)際應(yīng)用意義.

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

圖6 溫度和起始p H交互作用影響菌絲體生物量和胞外多糖濃度的等高線

圖7 溫度和搖床轉(zhuǎn)速交互作用影響菌絲體生物量和胞外多糖濃度的等高線

圖8 起始p H和搖床轉(zhuǎn)速交互作用影響菌絲體生物量和胞外多糖濃度的等高線

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以羊肚菌(Morchella)為材料,以單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn),研究了培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對羊肚菌菌絲體生物量和胞外多糖濃度的影響,篩選出了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比,優(yōu)化了羊肚菌液體發(fā)酵條件.單因素試驗(yàn)表明液體發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉和黃豆粉的最佳比例是10∶5.響應(yīng)面法優(yōu)化了羊肚菌液體發(fā)酵的最佳條件為溫度25.33℃、起始p H 6.13、搖床轉(zhuǎn)速154.33 r/min,羊肚菌菌絲生物量和胞外多糖濃度可達(dá)到最大,分別為7.78 g/L和130.97 mg/L.該試驗(yàn)用玉米粉和黃豆粉作為培養(yǎng)基,大大降低了生產(chǎn)成本,并且獲得的發(fā)酵產(chǎn)物也更加綠色健康,為大規(guī)模地工業(yè)化食用生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù).

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