蔣 忠，馮文利，王 偉，崔芳芳，卞璨慧

（濟南德馨齋食品有限公司，山東 濟南 250100）

醋酸是釀造食醋中有機酸的主要成分，與其他有機酸、糖分、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮類等微量化學(xué)成分形成食醋特有的色、香、味。而它們含量的高低以及比例關(guān)系直接影響到食醋的品質(zhì)[1]。有機酸是原料中淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)在釀造過程中轉(zhuǎn)化生成的。食醋中的糖類以葡萄糖、麥芽糖和果糖為主，其主要來源于多糖的水解，糖類能調(diào)和食醋口感，提高色澤和稠厚度。食醋中含有18種氨基酸，其中有8種人體必需氨基酸，其來源于蛋白質(zhì)水解和微生物菌體自溶，各種氨基酸呈味不同，能調(diào)和產(chǎn)品滋味，增加產(chǎn)品色澤和香氣，改善產(chǎn)品特性。氨基酸與糖類加熱發(fā)生羰基反應(yīng)，生成色素、香氣成分和功能性物質(zhì)[2]。

單純的醋酸具有刺激性嗅味、回味不長及調(diào)味差等缺點。只有多種有機酸如乳酸、檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸等不揮發(fā)酸存在，才能使食醋酸味綿長、柔和可口，具有增進(jìn)食欲、幫助消化的作用[2]。乳酸作為食醋中含量僅次于醋酸的一種有機酸，其不僅是食醋中不揮發(fā)酸的重要組成成分，也是食醋的重要呈味物質(zhì)。在食醋生產(chǎn)的酒精發(fā)酵階段酵母發(fā)酵過程中接入乳酸菌，在無氧條件下葡萄糖發(fā)酵過程中間產(chǎn)物丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下會轉(zhuǎn)化生成乳酸[3]。這樣不但能增加食醋中乳酸等不揮發(fā)酸含量，而且為形成食醋中的香氣主要成分——乳酸乙酯創(chuàng)造有利條件[4]。不揮發(fā)酸含量高的食醋刺激性小，能調(diào)和酸味，使食醋口感柔和；而酯類多數(shù)是具有芳香氣味的揮發(fā)性化合物，是食醋香氣的主要組成部分。此外乳酸菌還具有蛋白分解酶，能分解蛋白質(zhì)為短肽和氨基酸，從而使香味更加醇和[5]。

在液態(tài)深層制醋的發(fā)酵工藝中的酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段均為單一菌種參與發(fā)酵過程，且發(fā)酵周期較短，不利于芳香物質(zhì)的形成。雖然最終產(chǎn)酸較高，但其香氣成分含量較低[4]，致使液態(tài)發(fā)酵食醋的酸味不柔和，風(fēng)味和口感較差。為了改善液醋的風(fēng)味，提高食醋品質(zhì)，科研人員已進(jìn)行了大量的研究工作，提出了很多改進(jìn)方法和解決措施并取得了一定的效果[6-10]。本研究在液醋的酒精發(fā)酵階段接種酵母菌的同時接入乳酸菌，并在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗優(yōu)化了其酒精發(fā)酵工藝條件，采用乳酸菌與酵母菌共酵的方法最終提高液醋的不揮發(fā)酸及酯類含量，以期達(dá)到改善液醋感官品質(zhì)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃河大米：市售；酵母菌：安琪公司釀酒活性干酵母；乳酸菌、滬釀1.01醋酸菌：德馨齋微生物實驗室保藏；α-淀粉酶（40 000 U/mL）、糖化酶（100 000 U/mL）：山東隆大生物工程有限公司；試驗中所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

乳酸菌培養(yǎng)基[11]：葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙酸鈉0.5‰，MgSO4·7H2O 0.2‰，MnSO4·4H2O 0.01‰，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01‰，NaCl 0.01‰，pH 7.0，115 ℃滅菌20～30 min。

醋酸菌培養(yǎng)基[12]：葡萄糖1%，酵母膏1%，121 ℃滅菌30 min，溫度降至70 ℃時加入5%的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDX-35BI高壓滅菌鍋：上海精密儀器儀表有限公司；FA2004B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；78-1型恒溫培養(yǎng)箱：湖北黃石市醫(yī)療器械廠；pHS-3C型數(shù)顯酸度計；50 L深層液醋發(fā)酵罐：濟南市槐蔭區(qū)食品釀造機械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

操作要點：

浸米及磨漿：先將大米在清水中浸泡15 h，再把米與水以1∶6（g∶mL）的比例均勻放入鋼磨中，磨成細(xì)度為40目以上的米漿。

液化：米漿中按照10 U/g大米的添加量加入α-淀粉酶，并加入0.2%CaCl2以保護(hù)α-淀粉酶，提高其熱穩(wěn)定性。升溫至95 ℃并維持60 min，至碘反應(yīng)結(jié)束。再升溫至100 ℃并維持10 min，以達(dá)到滅菌的目的。

糖化：當(dāng)液化醪降溫至60 ℃時，按照150 U/g大米的添加量加入糖化酶，恒溫60 ℃并維持3～4 h。

酵母活化[13]：在干酵母量的15～20倍33～35 ℃的溫水中加入活性干酵母溶解活化30 min。

乳酸菌活化[10]：接種乳酸菌于培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 d。離心沉淀菌體，將上清液除去，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d?；罨?次后備用。

酒精發(fā)酵：當(dāng)糖化醪降溫至30 ℃時添加活化好的酵母菌和乳酸菌，攪拌均勻后置于恒溫30 ℃進(jìn)行酒精發(fā)酵。

醋酸發(fā)酵：將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪經(jīng)板框壓濾機過濾后加入液態(tài)深層醋酸發(fā)酵罐中，并以10%接種量接入擴培后的醋酸種子液進(jìn)行醋酸發(fā)酵。發(fā)酵溫度30～32 ℃，發(fā)酵初期通風(fēng)比1∶0.08，待凈增酸達(dá)到1 g/100 mL以后，調(diào)整通風(fēng)比為1∶0.10～1∶0.15。醋酸發(fā)酵開始30 min后取發(fā)酵醪檢測總酸含量，此后每隔2 h檢測總酸含量，待發(fā)酵接近終點每隔30 min檢測總酸含量，連續(xù)3次檢測總酸含量無變化時，加入1%NaCl終止醋酸發(fā)酵。

后處理：將常溫陳釀30 d的食醋經(jīng)硅藻土板框壓濾機過濾后，加熱至85 ℃滅菌，冷卻至常溫即為成品。

1.3.2 單因素試驗

酵母菌接種量的確定：按酵母菌接種量分別為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰，乳酸菌接種量6%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發(fā)酵3 d，考察酵母菌接種量對發(fā)酵液酒精度及乳酸含量的影響。

乳酸菌接種量的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發(fā)酵3 d，考察乳酸菌接種量對發(fā)酵液酒精度及乳酸含量的影響。

發(fā)酵溫度的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量6%于糖化醪中，分別置于26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃發(fā)酵3 d，考察發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酒精度及乳酸含量的影響。

發(fā)酵時間的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量分別為6%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發(fā)酵，分別在發(fā)酵24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h后，考察發(fā)酵時間對發(fā)酵液酒精度及乳酸含量的影響

1.3.3 正交試驗優(yōu)化乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵工藝條件

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平正交試驗，考察酵母菌接種量、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和時間4因素對發(fā)酵液酒精發(fā)酵階段酒精度和乳酸含量的影響。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 理化指標(biāo)和衛(wèi)生指標(biāo)檢測方法

酒精度檢測采用國標(biāo)GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的比重計法；總酸檢測采用國標(biāo)GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的方法；不揮發(fā)酸檢測采用國標(biāo)GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法；可溶性無鹽固形物采用國標(biāo)GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法。乳酸檢測采用國標(biāo)GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中總酸的方法；總酯檢測采用國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的電位滴定法。衛(wèi)生指標(biāo)檢測方法采用國標(biāo)GB/T 4789.22—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗調(diào)味品檢驗》中的方法。

1.3.5 感官評價

選取國家調(diào)味品評審委員在內(nèi)的9位專業(yè)人員從色澤、香氣、滋味和體態(tài)等4個方面對食醋樣品進(jìn)行感官評分，滿分100分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 食醋感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of vinegar

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌接種量對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響

酵母菌接種量對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母接種量對酒精度和乳酸含量的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and lactic acid content

由圖1可知，酵母菌接種量對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響比較明顯。隨著酵母菌接種量的提高，酒精度和乳酸含量均先增加后平穩(wěn)下降。當(dāng)酵母菌接種量為1.0‰時，二者數(shù)值達(dá)到最高值，分別為6.8%vol和0.50 g/100 mL，因此選擇酵母菌接種量1‰為宜。

2.2 乳酸菌接種量對酒度和乳酸含量的影響

乳酸菌接種量對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳酸菌接種量對酒精度和乳酸含量的影響Fig.2 Effect of lactic acid bacteria inoculum on alcohol content and lactic acid content

由圖2可知，乳酸菌接種量對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響不是很明顯。隨著乳酸菌接種量的提高，酒精度和乳酸含量基本維持不變。在乳酸菌接種量為6%時，酒精度和乳酸含量最大，分別為6.8%vol和0.50 g/100 mL。也由此看出乳酸菌的乳酸代謝發(fā)酵對酵母菌的酒精發(fā)酵過程沒有明顯干擾，對產(chǎn)酒精沒有抑制作用，對酵母菌還有一定的促進(jìn)作用。因此，選擇乳酸菌接種量為6%為宜。

2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度和乳酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and lactic acid content

由圖3可知，發(fā)酵溫度對酒精度和乳酸含量的影響明顯。酒精度和乳酸隨著發(fā)酵溫度的升高而先增加后下降。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，酒精度和乳酸均達(dá)到最大值，分別為6.8%vol和0.51 g/100 mL；當(dāng)發(fā)酵溫度＞30 ℃時，二者也都呈現(xiàn)下降趨勢，因此，選擇發(fā)酵溫度30 ℃為宜。

2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵液酒精度和乳酸含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對酒精度和乳酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and lactic acid content

由圖4可知，發(fā)酵時間對酒精度和乳酸含量的影響較明顯。酒精發(fā)酵前72 h隨著發(fā)酵時間的延長，酒精度和乳酸含量均呈逐漸上升的趨勢；發(fā)酵時間在72 h，酒精度達(dá)到最大值，為6.8%vol，發(fā)酵時間＞72 h以后隨著底物耗盡，酒精度開始呈現(xiàn)下降趨勢，乳酸含量趨于平穩(wěn)。因此，考慮實際生產(chǎn)情況選擇發(fā)酵時間72 h為宜。

2.5 發(fā)酵工藝條件正交優(yōu)化結(jié)果分析

綜合以上單因素發(fā)酵試驗結(jié)果，在酒精發(fā)酵階段以酒精度和乳酸含量為評價指標(biāo)，選取酵母菌接種量（A）、乳酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因素，設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化工藝條件，結(jié)果與分析見表3，正交試驗方差分析分別見表4、表5。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，影響發(fā)酵液酒精度的因素主次關(guān)系是A＞C＞B＞D，有利于酒精生產(chǎn)的最優(yōu)組合是A2B1C2D2，即酵母菌接種量（A）1.0‰，乳酸菌接種量（B）5%，發(fā)酵溫度（C）30 ℃，發(fā)酵時間（D）72 h；影響乳酸含量的因素主次關(guān)系是B＞D＞A＞C，有利于乳酸生產(chǎn)的最優(yōu)組合是A2B3C3D2，即酵母菌接種量1.0‰，乳酸菌接種量7%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間72 h。

表4 以酒精度為評價指標(biāo)正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index

由表4可知，以酒精度為評價指標(biāo)因素酵母菌接種量（A）顯著，因素乳酸菌接種量（B）和發(fā)酵溫度（C）不顯著，因素作用的主次順序是A＞C＞B，與極差分析得出的結(jié)果一致。

表5 以乳酸含量為評價指標(biāo)正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using lactic acid content as evaluation index

由表5可知，以乳酸為評價指標(biāo)因素乳酸菌接種量（B）顯著，因素酵母菌接種量（A）和發(fā)酵時間（D）不顯著，因素作用的主次順序是B＞D＞A，與極差分析得出的結(jié)果一致。

由于兩指標(biāo)單獨分析出來的最優(yōu)條件并不一致，因此采取綜合平衡法[14]綜合考慮各因素對指標(biāo)的影響，從而得到最優(yōu)條件。綜合分析，酒精發(fā)酵階段乳酸菌和酵母菌共酵的最優(yōu)工藝條件為A2B1C2D2，即酵母菌接種量1.0‰，乳酸菌接種量5%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間72 h。在此條件下進(jìn)行驗證試驗，獲得食醋產(chǎn)品的酒精度和乳酸含量分別達(dá)到7.8%vol和0.54 g/100 mL。

2.6 食醋質(zhì)量分析

采用優(yōu)化的乳酸菌和酵母菌共酵工藝以及單獨使用酵母菌（對照）進(jìn)行酒精發(fā)酵，再進(jìn)行液態(tài)深層醋酸發(fā)酵，并陳釀相同時間后得到的2組食醋產(chǎn)品，分別為共酵組和對照組。對2組產(chǎn)品進(jìn)行感官評價并檢測相關(guān)理化衛(wèi)生指標(biāo)。

2.6.1 感官評價

共酵組食醋呈現(xiàn)淡黃色、有光澤；有淡淡酯香氣味、酸味柔和醇厚、略帶甜味、無異味；清亮透明、無懸浮物、無沉淀物。2組樣品感官評分結(jié)果見圖5。

圖5 液醋感官測評結(jié)果對比Fig.5 Comparison of sensory evaluation results of vinegar

由圖5可知，共酵組產(chǎn)品感官評分總分高于對照組樣品，主要體現(xiàn)在其香氣和滋味2個項目上的得分均優(yōu)于對照組，而在色澤和體態(tài)方面2組得分相差不大。

2.6.2 理化指標(biāo)

理化指標(biāo)檢測結(jié)果如表6所示。

表6 2組食醋樣品理化指標(biāo)檢測結(jié)果對比Table 6 Comparison of physical and chemical indexes results of vinegar

由表6可知，共酵組和對照組在總酸含量相差不大，共酵組產(chǎn)品不揮發(fā)酸、總酯和可溶性無鹽固形物含量均明顯高于對照組。特別是不揮發(fā)酸含量是對照組的10倍以上，酯類含量是對照組的1.6倍以上，這對改善食醋感官品質(zhì)很有利[3]。

2.6.3 衛(wèi)生指標(biāo)

兩組食醋樣品菌落總數(shù)≤50 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌：不得檢出。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交優(yōu)化試驗對酒精發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得乳酸菌與酵母菌最佳共酵條件為酵母菌接種量1.0‰、乳酸菌接種量5%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間72 h，在此條件下獲得酒醪的酒精度和乳酸含量分別達(dá)到7.8%vol和0.54 g/100 mL。且用該酒醪經(jīng)液態(tài)深層法釀造的食醋呈現(xiàn)淡黃色、清亮透明、有光澤，較純酵母酒精發(fā)酵生產(chǎn)的食醋有較濃酯香氣味、酸味更柔和醇厚，質(zhì)量指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 18187—2000《釀造食醋》[15]，改善了液態(tài)發(fā)酵食醋的品質(zhì)。

[1]劉楊岷，楊家驪，王利平，等.食醋風(fēng)味成分比較研究[J].食品與機械，2005，21（5）：40-42.

[2]趙德安.改進(jìn)液態(tài)深層發(fā)酵醋風(fēng)味的設(shè)想[J].江蘇調(diào)味副食品，2005，22（5）：6-9.

[3]李大錦，王汝珍.提高液態(tài)深層發(fā)酵食醋風(fēng)味的實用技術(shù)[J].中國釀造，2005，24（1）：4-9.

[4]胡文浪.關(guān)于提高液態(tài)食醋質(zhì)量的探討[J].中國釀造，2005，24（8）：40-43.

[5]王夫杰，魯 緋，紀(jì)鳳娣，等.乳酸菌在中國傳統(tǒng)釀造調(diào)味品中的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品，2009（9）：24-26.

[6]國建娜.玫瑰醋糖化與酒精發(fā)酵過程工藝參數(shù)優(yōu)化的研究[D].杭州：浙江工商大學(xué)碩士論文，2009.

[7]尹永琪，張書玉，韓永斌，等.紫甘薯醋酒精發(fā)酵階段混菌發(fā)酵工藝條件優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2003，34（11）：188-192.

[8]趙春燕，王 鵬，王淑琴，等.液態(tài)發(fā)酵食醋增香調(diào)色的研究[J].中國釀造，2008，27（19）：59-61.

[9]孫峰宇.乳酸菌的分離鑒定及在食醋釀造中的應(yīng)用[D].天津：天津科技大學(xué)碩士論文，2013.

[10]林 汲，趙紅年.多菌種復(fù)合制曲技術(shù)研究[J].中國釀造，2014，33（4）：75-79.

[11]王博彥，金其榮.發(fā)酵有機酸生產(chǎn)及應(yīng)用手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[12]上海市釀造科學(xué)研究所.發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2007.

[13]俞學(xué)峰.生香活性干酵母在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，1999，18（5）：138-141.

[14]李志西，杜雙奎.實驗優(yōu)化設(shè)計與統(tǒng)計分析[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[15]石家莊珍極釀造集團(tuán)有限公司.GB 18187—2000 釀造食醋[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.