倪偉建，丁海華，唐麗琴，2，魏　偉

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽合肥　230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，安徽合肥　230001)

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小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎組織VEGF表達(dá)的影響

倪偉建1，丁海華1，唐麗琴1，2，魏偉1

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽合肥230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，安徽合肥230001)

摘要:目的觀察小檗堿(berberine，BBR)對糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠腎臟的保護(hù)作用。方法采用高糖高脂飼料聯(lián)合低劑量(35 mg·kg(－1))鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠模型。隨機(jī)分為空白對照組、模型組、BBR(50 mg·kg(－1))、BBR(100 mg· kg(－1))和BBR(200 mg·kg(－1))劑量治療組結(jié)果。分別在給藥2、4、6、8周時(shí)檢測大鼠空腹血糖變化，給藥8周后測定大鼠血肌酐和尿素氮含量，尿總蛋白含量的變化; PAS染色觀察DN腎臟組織病理學(xué)改變;免疫組織化學(xué)法檢測腎臟組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá); Western blot法檢測DN腎臟組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平。結(jié)果與正常對照組相比，模型組血糖及尿總蛋白指標(biāo)明顯升高，產(chǎn)生明顯的形態(tài)學(xué)異常變化，同時(shí)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，小檗堿給藥組大鼠血糖和尿總蛋白量均明顯下降;同時(shí)血液指標(biāo)血肌酐和尿素氮水平也不同程度的下降;另外，BBR給藥組還可明顯改善糖尿病腎病大鼠腎臟病理學(xué)異常，降低腎臟血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。結(jié)論小檗堿可明顯改善糖尿病腎病大鼠發(fā)病過程中的生化指標(biāo)和腎臟病理損傷，這可能與其影響糖尿病腎病狀態(tài)下腎臟組織中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:小檗堿;糖尿病腎病;血管內(nèi)皮生長因子;腎小球;足細(xì)胞;腎臟保護(hù)作用

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是造成終末期腎病(ESRD)的最常見原因之一，約有20%－40%的糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展到糖尿病腎病階段［1］。早期DN以腎小球高濾過和尿微量白蛋白為特征，隨著疾病發(fā)展逐漸產(chǎn)生腎小球萎縮、腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)堆積和系膜腫脹變形等，最終導(dǎo)致慢性腎功能不全，直接影響糖尿病患者的生活質(zhì)量及威脅其生命［2］。早期以微量白蛋白尿?yàn)樘卣鳎似谌绮扇〈胧?、積極防治，可延緩或阻止其進(jìn)入臨床蛋白尿期。而一旦出現(xiàn)臨床蛋白尿，則腎功能損害的速度將加快，所以探討糖尿病腎病的早期防治方法則顯得尤為重要［3］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的絲裂原，已發(fā)現(xiàn)VEGF與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，系膜區(qū)VEGF表達(dá)增加可促進(jìn)系膜區(qū)蛋白外滲，血管外基質(zhì)增加而導(dǎo)致系膜區(qū)體積增大。另外，VEGF也可引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，通過影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)蛋白尿的形成［4］。給與VEGF單克隆抗體或血管生成抑制劑可緩解實(shí)驗(yàn)性糖尿病鼠腎高濾過、腎臟萎縮、腎重和白蛋白排泄，提示VEGF與糖尿病腎病階段的血管結(jié)構(gòu)改變，血管新生有關(guān)［5］。因此，抑制VEGF的過表達(dá)對延緩DN的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著重要的理論意義和臨床價(jià)值。

小檗堿(berberine，BBR)是從毛茛科植物黃干燥根狀莖及黃柏皮中提取的一種異喹啉生物堿類。研究表明，BBR具有降低血糖、降脂及內(nèi)皮依賴性舒張血管等作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)和相關(guān)的研究表明，BBR可改善DN大鼠腎功能，減少蛋白尿的產(chǎn)生，這表明BBR可以減輕DN大鼠腎損害，但該作用的確切機(jī)制并不明確［6］。本研究在前期模型誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，建立了更為合適的DN大鼠模型，觀察BBR對DN大鼠腎臟中VEGF表達(dá)的影響［7］。

1　材料與方法

1.1材料清潔級(jí)♂SD大鼠，體質(zhì)量(180±20) g(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):皖醫(yī)動(dòng)第028號(hào)) ;普通飼料及高糖高脂飼料(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中高糖高脂飼料配方為:基礎(chǔ)飼料64.0%，豬油8.0%，蛋黃粉10.0%，蔗糖18.0%，膽酸鈉1.0%) ; STZ(美國Sigma公司) ;小檗堿(安徽省立醫(yī)院藥劑科提供，含量大于96.5%)。兔抗VEGF多克隆抗體(bs-1313R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(批號(hào): K145619C，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司) ; SP9000通用性SP檢測試劑盒(批號(hào): WK141515，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司) ;超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(34094，Thermo scientific)。

1.2實(shí)驗(yàn)性SD大鼠模型的制備及分組♂SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，誘發(fā)產(chǎn)生胰島素抵抗。禁食不禁水12 h后，測定血糖作為基礎(chǔ)血糖，然后按35 mg·kg－1劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)建立DN大鼠模型，72 h后尾靜脈檢測空腹血糖。造模成功大鼠隨機(jī)分為: DN組，BBR(50 mg·kg－1)、BBR(100 mg·kg－1)和BBR(200 mg·kg－1)治療組，每組12只，繼續(xù)喂以高糖高脂飼料8周。另設(shè)正常對照組，喂以基礎(chǔ)飼料。各治療組均灌胃給藥相應(yīng)濃度小檗堿，正常組和對照組以等量溶媒(0.5% CMC-Na)灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

1.3指標(biāo)觀察及方法

1.3.1生化指標(biāo)檢測采用愛樂芬血糖儀配套試紙測定大鼠空腹血糖(FBG)水平，記錄各組大鼠的血糖變化。給藥8周后，同時(shí)測定各組大鼠血肌酐和尿素氮的含量。給藥8周結(jié)束后，將大鼠放入代謝籠中，收集24h尿液，取上清，測定尿總蛋白(UTP)含量。取部分腎臟，10%甲醛溶液固定后切片，待做PAS染色和免疫組化分析。

1.3.2腎臟病理學(xué)檢查取實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟組織，置于冰臺(tái)用PBS沖洗干凈，除去包膜，濾紙吸干，取左腎沿冠狀面剖開，投入10%甲醛中性緩沖溶液固定，石蠟包埋，3μm切片，常規(guī)用二甲苯脫蠟至水，加入0.5%～1%高碘酸氧化，Schiff液避光染色，0.5%偏重亞硫酸鈉(鉀)浸洗，蘇木精染色，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變情況。

1.3.3腎臟VEGF免疫組織化學(xué)分析按照通用型過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素檢測試劑盒的相關(guān)要求檢測VEGF蛋白的表達(dá)。取大鼠的腎臟組織，置于體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、3 μm切片，常規(guī)脫蠟、水化、組織抗原修復(fù)后，滴加正常山羊血清封閉，室溫20 min;滴加一抗(VEGF兔抗大鼠多克隆抗體)，4℃過夜; 37℃復(fù)溫20 min; PBS洗3次;滴加二抗(生物素標(biāo)記山羊抗兔抗體)，37℃孵育30 min; PBS洗3次;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵15 min; PBS洗3 次;以DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。陽性物質(zhì)呈棕色或褐色顆粒狀，以PBS代替一抗進(jìn)行陰性對照實(shí)驗(yàn)。采集高倍視野(×200倍)圖像，Image-Pro Plus分別對切片免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析，測定組織中蛋白染色平均光密度值并分析。

1.3.4腎臟VEGF蛋白表達(dá)分析常規(guī)裂解腎皮質(zhì)(RIPA∶PMSF=99∶1)，提取總蛋白。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。取20 μL樣品蛋白上樣，SDS/PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，牛奶/TPBS封閉液室溫封閉2 h。放入稀釋度為1∶500的一抗(VEGF多抗)中4℃過夜，次日加入1 ∶5萬稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。ECL試劑盒顯影，結(jié)果用Image Quant Las 4000mini凝膠成像系統(tǒng)掃描存盤，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理腎組織免疫組化切片采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析，Western blot結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行分析，測定平均光密度。計(jì)量資料采用±s表示，用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較及方差分析，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1BBR對DN大鼠生化指標(biāo)影響

2.1.1BBR對DN大鼠血糖值的影響各組大鼠的經(jīng)STZ造模成功后，每2周檢測動(dòng)物的空腹血糖水平。與正常對照組(NC)比較，模型組動(dòng)物的血糖水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ; BBR中、高劑量組血糖值從4周開始明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Fig 1。

Fig 1 Effect of BBR on FBG in different stage ofDN rats (±s)

2.1.2BBR對DN大鼠尿蛋白的影響糖尿病腎病模型組血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平和尿總蛋白(UTP)量明顯高于對照組(P＜0.01)。BBR (50 mg·kg－1)治療組可以改善增高的UTP水平(P＜0.05)，而對血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平無明顯影響; BBR(100 mg·kg－1)與BBR(200 mg·kg－1)治療組均可明顯改善血肌酐(SCr) (P＜0.01)和尿素氮(BUN) (P＜0.05)水平以及尿總蛋白(UTP) (P＜0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of BBR on levels of UTP，SCr andBUN production in DN rats(±s)

2.1.3BBR對DN大鼠腎臟組織病理學(xué)變化的影響腎臟病理檢查顯示對照組腎小球、小管間質(zhì)、腎血管未見明顯異常，而糖尿病組出現(xiàn)明顯的腎臟萎縮，系膜基質(zhì)逐漸增多，腎小管擴(kuò)張，出現(xiàn)腎小球硬化征象。BBR不同劑量給藥后觀察發(fā)現(xiàn)BBR(50 mg·kg－1)治療組并無明顯變化;而BBR(100 mg ·kg－1)和BBR(200 mg·kg－1)治療組均顯示不同程度程的腎臟體積恢復(fù)，系膜細(xì)胞腫脹減少，有效地改善了腎臟萎縮和纖維化的狀態(tài)，其中BBR(200 mg·kg－1)較BBR(100 mg·kg－1)改善作用明顯。見Fig 2。

2.2BBR對DN大鼠腎臟組織VEGF表達(dá)的影響

2.2.1免疫組化結(jié)果分析取實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟進(jìn)行VEGF免疫組化檢查。采集高倍視野(×200倍)圖像，采用Image-Pro Plus軟件分別對切片免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析，測定組織中蛋白染色平均光密度值。腎臟組織免疫組化結(jié)果顯示:正常對照組大鼠腎組織VEGF的表達(dá)呈弱陽性，DN模型大鼠腎組織VEGF呈強(qiáng)陽性表達(dá); BBR(50、100、200 mg·kg－1)給藥對大鼠腎臟上述指標(biāo)表達(dá)有不同程度的降低作用，其中BBR(100、200 mg·kg－1)作用效果明顯，與模型組大鼠差異有顯著性(P＜0.01)。見Fig 3。

2.2.2Western blot結(jié)果分析取實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟進(jìn)行，分離腎皮質(zhì)并裂解，提取總蛋白進(jìn)行VEGF的Western blot檢查。采用Image J軟件分別對條帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: DN模型大鼠腎組織VEGF表達(dá)較正常對照組明顯增加(P＜0.01) ; BBR(50、100、200mg·kg－1)給藥對大鼠腎臟上述指標(biāo)表達(dá)均產(chǎn)生不同程度的降低腎皮質(zhì)VEGF的表達(dá)的作用，與模型組大鼠差異有顯著性(P＜0.05; P＜0.01)。見Fig 4。

Fig 2 Effect of BBR on pathological changes in kidney tissue (×400)

Fig 3 Effect of BBR on expression of VEGF in kidney tissue (×200)

Fig 4 Effect of BBR on the expression of VEGFin kidney tissue (±s，n=4)

3　討論

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝障礙疾病，而糖尿病腎病(DN)是糖尿病的較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，最終可能導(dǎo)致慢性腎功能不全和終末期腎衰竭，直接影響患者的生活質(zhì)量并嚴(yán)重威脅其生命［8］。DN除表現(xiàn)為血糖異常升高外，還常常伴有蛋白質(zhì)和脂肪等的代謝紊亂和腎臟等組織病變損傷［9］。實(shí)驗(yàn)顯示BBR可明顯降低糖尿病及其并發(fā)癥的血糖。另外，BBR還被證明能夠降低高脂飲食動(dòng)物的血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平。最近，有研究證實(shí)BBR對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用［10］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病早期用BBR治療能夠明顯延緩DN的發(fā)生，BBR通過抑制腎臟炎癥因子的釋放，減輕糖尿病時(shí)腎臟的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制部分取決于對PGE2-EP受體相關(guān)信號(hào)通路的抑制作用［11］; Domitrovic等［12］研究發(fā)現(xiàn)BBR對由順鉑(cisplatin，CP)誘導(dǎo)的腎臟損傷大鼠具有一定的腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能由于BBR通過減少CYP2E1的表達(dá)以及對NF-κB通路的抑制作用所引起的，此實(shí)驗(yàn)中BBR發(fā)揮腎臟保護(hù)作用具有劑量依賴性。本課題組研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下TGF-β1的表達(dá)明顯增加，不僅促進(jìn)炎癥因子的釋放產(chǎn)生炎癥作用，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白成分如: Fibronectin和Ⅳ型膠原的合成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，引起腎小球硬化和糖尿病腎臟纖維化，而BBR治療可以改善上述病理變化，提示BBR具有較好的保護(hù)糖尿病腎病時(shí)腎臟的作用［13］。

VEGF是一種促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和蛋白滲透作用的分子，參與了微血管的生理和病理過程，正常人血漿和各組織中VEGF水平較低，僅維持正常生理功能。生理狀態(tài)下，腎臟組織VEGF主要表達(dá)于腎小球臟層上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)，但體外培養(yǎng)的腎組織固有細(xì)胞如腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞也存在VEGF基因，可合成和分泌一定量的VEGF蛋白［14］。目前VEGF在DN中的作用研究較少，對于VEGF在DN中的作用機(jī)制尚不清楚［15］。目前研究認(rèn)為導(dǎo)致2型糖尿病患者VEGF升高的機(jī)制可能在于疾病狀態(tài)下的高血糖作用。血糖的異常升高一方面直接激活蛋白激酶C (PKC)，使特定的轉(zhuǎn)錄因子磷酸化進(jìn)而增加VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腎小球足細(xì)胞和系膜細(xì)胞中VEGF的表達(dá);同時(shí)，高糖環(huán)境也可以促進(jìn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)，使血液中血管緊張素II (ATII)水平明顯升高。而ATII的高表達(dá)又會(huì)通過激活二?；视退交罨鞍准っ傅摩聛喰?，促進(jìn)VEGF基因表達(dá)，從而刺激腎小球足細(xì)胞和系膜細(xì)胞合成并分泌VEGF［16］。也有研究認(rèn)為缺氧會(huì)引起VEGF表達(dá)的增多，但其具體機(jī)制目前還不清楚。糖尿病腎病發(fā)生時(shí)患者上皮細(xì)胞損傷會(huì)產(chǎn)生大量VEGF，致使VEGF異常增多，引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞功能異常改變，增加腎小球通透性和腎小球?yàn)V過率從而促進(jìn)蛋白外滲，血管外基質(zhì)增加而導(dǎo)致腎小球病變，進(jìn)而引起腎小球硬化和腎臟纖維化，隨后引起腎臟萎縮，加重糖尿病腎病［17］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在糖尿病腎病狀態(tài)下，DN大鼠血糖水平、血肌酐、尿素氮以及尿總蛋白量等生化指標(biāo)較正常對照組大鼠明顯升高，同時(shí)伴有腎臟組織VEGF的表達(dá)明顯增多，BBR給藥可以明顯降低DN大鼠腎組織VEGF的異常表達(dá)，改善了VEGF異常增多引起的腎小球功能的紊亂，降低了VEGF異常升高所引起的腎小球高濾過和尿總蛋白堆積，從而減輕VEGF對腎小球和腎間質(zhì)的損傷，提示對VEGF蛋白水平的影響可能是BBR發(fā)揮腎臟保護(hù)作用和治療DN大鼠的機(jī)制之一。同時(shí)BBR發(fā)揮治療作用提示我們中藥小檗堿在糖尿病及其并發(fā)癥的治療上具有重要的研究價(jià)值。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)完成于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)過程中得到臨床藥理研究所全體老師和同學(xué)的幫助。實(shí)驗(yàn)中所涉及的病理技術(shù)得到安徽省立醫(yī)院病理科胡聞老師的技術(shù)支持，在此表示感謝。)

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Effect of berberine on expression of vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy rats

NI Wei-jian1，DING Hai-hua1，TANG Li-qin1，2，WEI Wei1
(1.Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Antiinflammatory and Immune Medicine，Anhui Medical University; Ministry of Education，Hefei 230032，China; 2.Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，China)

Abstract:AimTo investigate the renoprotective effect of berberine in diabetic nephropathy rat model.

Methods The rat model of DN was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) after fed with high sugar and high fat diet for six weeks.The rats were divided into 5 groups randomly，i.e.normal control group，model group，BBR (50 mg·kg－1)，BBR (100 mg·kg－1) and BBR (200mg·kg－1) treatment group.The fasting blood glucose (FBG) was evaluated at 2，4，6，8 week respectively.The pathological changes in the kidney were determined by PAS staining.The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by immunohistochemistry and Western blot respectively.ResultsCompared with normal control group，the value of FBG，SCr，BUN and UTP of model group were sharply increased. Compared with model group，the value of FBG in berberine different dosage treatment groups were significantly decreased to various degrees，and berberine different dosage treatment could decrease the levels of SCr，BUN and UTP in different degree.Berberine could surpress the alterations of pathological changes in the kidneys and downregulate the expression levels of VEGF in the kidney of diabetic rats with nephropathy.

ConclusionBerberine could significantly ameliorate the biochemical indicators and renal injury of the model rats through affecting the abnormal expression levels of VEGF in the kidney.

Key words:berberine; diabetic nephropathy; vascular endothelial growth factor; glomerulus; podocyte; renoprotective effect

作者簡介:倪偉建(1990－)，男，碩士生，研究方向:內(nèi)分泌及代謝藥理學(xué)，E-mail: jayni1990@126.com;唐麗琴(1972－)，女，博士，教授，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:?內(nèi)分泌及代謝藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: tulcyl@ vip.sina.com;魏偉(1960－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: wwei@ ahmu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81102864，81073109) ;安徽省中醫(yī)藥科研課題(No 2012zy48)

收稿日期:2015－01－17，修回日期:2015－02－27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0795－06中國圖書分類號(hào): R-332; R284.1; R322.61; R587.2; R977.6

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.012