張哲，王超

(河北省人民醫(yī)院省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊　050051)

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KLF4在糖尿病小鼠心肌組織的表達(dá)及通心絡(luò)膠囊干預(yù)作用研究

張哲，王超

(河北省人民醫(yī)院省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050051)

摘要:目的探討糖尿病小鼠心肌組織Krüppel樣因子4 (KLF4)表達(dá)及通心絡(luò)(TXL)對(duì)其干預(yù)作用。方法KK/Upj-Ay小鼠40只，隨機(jī)分為糖尿病模型組、TXL低、中、高劑組，每組10只，另設(shè)C57BL/6(C57)小鼠10只作為對(duì)照組。按照分組給予不同劑量處理因素，療程3個(gè)月，測(cè)定各組空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)，空腹胰島素(FINS)、計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR) ;放射免疫法測(cè)定各組血清TNF-α、IL-6水平; HE染色觀察心肌組織病理變化; Real time-PCR和Western blot測(cè)定心肌組織KLF4 mRNA和蛋白表達(dá); Western blot測(cè)定心肌組織核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)核蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組FBG、HbA1c、TG、TC、FINS、HOMA-IR及TNF-α、IL-6水平明顯增高，KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，NF-κB核蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，通心絡(luò)膠囊能夠明顯減輕心肌組織病理損傷，降低FINS、TG、TC、HOMA-IR、TNF-α、IL-6水平及NF-κB核蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)KLF4表達(dá)(P＜0.05)，但不影響FBG、HbA1c(P＞0.05)。結(jié)論KLF4可能參與了糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。通心絡(luò)膠囊可減輕糖尿病心肌病理損傷及改善心功能，其機(jī)制可能與上調(diào)KLF4表達(dá)及抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞:通心絡(luò)膠囊;糖尿病心肌病; Krüppel樣因子4;血糖;血脂; NF-κB;炎癥;信號(hào)通路

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病晚期并發(fā)癥之一，主要臨床表現(xiàn)為心臟收縮和舒張功能障礙、心律失常甚至心力衰竭［1］。目前，有關(guān)DCM的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究顯示，糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、微血管病變、細(xì)胞凋亡等多種病理變化參與了DCM的發(fā)生發(fā)展，其中胰島素抵抗貫穿于糖尿病的始末，是DCM發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor 4，KLF4)是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、炎癥和腫瘤形成等生理和病理過程。我們前期研究表明KLF4過表達(dá)具有明顯的改善骨骼肌胰島素抵抗的作用，提示KLF4在胰島素抵抗形成中發(fā)揮重要作用［3］。Yoshida等［4］最近研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化、血管損傷等心血管疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，結(jié)合我們的研究結(jié)果提示了KLF4可能在DCM發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而，有關(guān)KLF4在DCM發(fā)病機(jī)制中的作用目前尚未見報(bào)道。本研究以自發(fā)性糖尿病模型KK/Upj-Ay小鼠為研究對(duì)象，觀察KLF4在DCM心肌組織的表達(dá)情況，探討通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為DCM的中醫(yī)藥治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器兔抗KLF4、NF-κB p65﹑GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。TNF-α、IL-6放免試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。TRIzol、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。通心絡(luò)膠囊(批號(hào): 060739，衛(wèi)藥準(zhǔn)字:97-Z-001號(hào))由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。

7080全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，Mastercycler gradient PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，ABI PRISM 7300 PCR System(美國(guó)Applied Biosystems)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及給藥選取12周齡SPF 級(jí)KK/Upj-Ay和C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量分別為30～40 g和25～30 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，(20～25)℃常規(guī)飼養(yǎng)。按空腹血糖值(FBG)將40只KK/Upj-Ay小鼠分為4組:糖尿病模型組、TXL低劑量(1 g生藥·kg－1)、中劑量(2 g生藥·kg－1)、高劑量(4 g生藥·kg－1)組，另設(shè)C57BL/6小鼠10只為對(duì)照組，對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水，每天1次灌胃給藥，療程3個(gè)月。每周測(cè)量并記錄各組FBG、HbA1c、TG及TC。

1.2.2心功能檢測(cè)給藥12周后，小鼠禁食12 h，稱重，按照30 mg·kg－1劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定。分離右頸總動(dòng)脈，將心室插管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插至左心室，連接生物信號(hào)記錄儀測(cè)定左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左心室最大收縮/舒張速率(the maximum rate of myocardial contraction and the maximum rate of myocardial diastole，±dp/dtmax)。

1.2.3HE染色取小鼠冠狀切面心肌組織，置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色。高倍鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)分別測(cè)定左心室前壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)和室間隔厚度(interventricular septal thickness，IST)。每組3～4只動(dòng)物，每只動(dòng)物觀察2張切片，取平均值。

1.2.4放射免疫法12周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行斷尾取血法，將3 ml血3 500 r·min－1離心10 min，取上清，－80℃保存。采用放射免疫法測(cè)定外周血TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5Real-time PCR根據(jù)GenBank中小鼠KLF4 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見Tab 1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TRIzol提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。PCR擴(kuò)增完畢，進(jìn)入ABI 7300型熒光定量PCR儀附帶的SDS v1.3軟件結(jié)果分析界面，設(shè)基線為3～15個(gè)循環(huán)，得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值。設(shè)對(duì)照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，目的基因表達(dá)水平的相對(duì)定量值RQ=2－△△Ct，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析，設(shè)GAPDH為內(nèi)參照基因。

Tab 1 Primers sequence for Real-time PCR and product length

1.2.6Western blot取心肌組織，常規(guī)方法提取總蛋白，測(cè)定KLF4蛋白水平，采用Deryckere and Gannon法提取核蛋白測(cè)定NF-κB p65蛋白水平，BCA法進(jìn)行蛋白定量，按4∶1體積比加入5×上樣緩沖液內(nèi)混勻，100℃煮沸5 min變性，置于－20℃冰箱備用。將100 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉2 h。用特異性抗NF-κB p65抗體(1∶2 000稀釋) 4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件檢測(cè)并分析蛋白條帶IOD值，GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0軟件包處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示。兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用Dunnett t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠糖脂代謝指標(biāo)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的高血糖和高血脂，F(xiàn)BG、HbA1c、TG、TC、FINS、HOMA-IR均明顯增高(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組TG、TC、FINS水平及HOMA-IR不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)FBG、HbA1c亦有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示通心絡(luò)膠囊具有明顯的降脂作用，但無降糖作用。見Tab 2。

Tab 2 Effects of TXL on levels of blood sugar and blood lipids in DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 2 Effects of TXL on levels of blood sugar and blood lipids in DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　FBG/mmol·L－1　HbA1c/%　TG/mmol·L－1　TC/mmol·L－1　FINS/pmol·L－1HOMA-IR Control　5.56±0.89　5.06±0.48　0.88±0.31　1.75±0.54　34.13±4.58　2.49±0.42 Model　18.97±3.18＊＊　12.31±3.26＊＊　1.52±0.68＊＊　5.79±2.53＊＊　98.28±13.46＊＊　22.76±3.75＊＊TXL low dose　16.75±2.77　10.72±2.56　1.48±0.75　5.36±2.84　89.22±16.45　20.46±5.13 TXL middle dose 15.56±2.34　10.24±2.32　1.27±0.75#　3.13±1.47#　63.65±9.34#　9.20±3.28#TXL high dose　15.12±2.86　9.79±1.84　1.02±0.44#　1.84±0.68#　41.21±6.15#　3.78±0.52#

2.2通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠心功能的影響心功能指標(biāo)中LVSP、+ dp/dtmax反映心臟的收縮功能，LVEDP、－dp/dtmax反映心臟的舒張功能。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組LVSP、+ dp/dtmax、－dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組LVSP、+ dp/dtmax、－dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示通心絡(luò)膠囊能夠明顯改善DCM小鼠心臟收縮和舒張功能。見Tab 3。

Tab 3 Effects of TXL on cardiac function in DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 3 Effects of TXL on cardiac function in DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

+dp/dtmax/－dp/dtmax/Group　LVSP/kPa　LVEDP/kPa kPa·s－1kPa·s－1Control　15.77±1.66　0.07±0.03　844±70　778±67 Model　5.83±0.68＊＊0.64±0.16＊＊　309±30＊＊　270±29＊＊TXL low dose　6.84±0.77　0.57±0.19　334±32　301±32 TXL middle dose　11.77±1.10#　0.19±0.08#　685±58#　629±56#TXL high dose　12.71±1.24#　0.11±0.06#　761±62#　669±59#

2.3通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠體質(zhì)量、心室壁厚度的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，同時(shí)體質(zhì)量明顯降低，室間隔厚度(IST)和左心室前壁厚度(LVWT)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組IST、LVWT明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示通心絡(luò)膠囊能夠明顯抑制DCM小鼠心肌肥厚和心室重構(gòu)。見Tab 4。

Tab 4 Effects of TXL on body weight and heart wall thickness in DCM mice±s，n=10)

Tab 4 Effects of TXL on body weight and heart wall thickness in DCM mice±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　Body weight/g　IST/mm　LVWT/mm Control　40.48±2.75　0.78±0.08　1.98±0.31 Model　30.23±2.17＊＊　1.54±0.13＊＊　2.68±1.05＊＊TXL low dose　30.44±3.42　1.49±0.18　2.59±1.26 TXL middle dose　32.08±2.23　1.26±0.12#　2.31±1.35#TXL high dose　33.41±2.67　1.02±0.11#　2.12±0.89#

2.4通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響為觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響，我們采用放射免疫法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組TNF-α、IL-6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示通心絡(luò)膠囊能夠明顯抑制DCM小鼠心肌炎癥反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)在心肌的積聚。見Tab 5。

Tab 5 Effects of TXL on serum TNF-α and IL-6 levelsin DCM mice(珋±s，n=10)

Tab 5 Effects of TXL on serum TNF-α and IL-6 levelsin DCM mice(珋±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

Group　TNF-α/mol·L－1　IL-6/mol·L－1Control　0.82±0.13　1.05±0.07 Model　2.77±0.30＊＊　3.22±0.43＊＊TXL low dose　2.53±0.36　3.16±0.49 TXL middle dose　1.62±0.18#　2.23±0.26#TXL high dose　0.98±0.15#　1.41±0.11#

2.5通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠心肌組織病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組小鼠心肌HE染色可觀察到心肌細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，無腫脹壞死;模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，邊界不清，線粒體腫脹，細(xì)胞核固縮、裂解甚至丟失，肌原纖維斷裂、分離，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出現(xiàn)多發(fā)壞死灶;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)有不同程度改善，壞死灶面積明顯減小，提示通心絡(luò)膠囊能夠明顯減輕DCM小鼠心肌形態(tài)學(xué)損傷。見Fig 1。

Fig 1 Comparison of HE staining of myocardium in different groups(HE×400)

2.6通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠心肌組織KLF4表達(dá)的影響Real time-PCR和Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，模型組KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)分別降低了64.5%和73.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示通心絡(luò)膠囊可能通過上調(diào)DCM小鼠心肌KLF4表達(dá)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。見Fig 2。

Fig 2 Effects of TXL on the expression of KLF4 mRNA(A) and protein(B) in cardiac tissue(±s，n=10)

1: Control; 2: Model; 3: TXL low dose; 4: TXL middle dose; 5: TXL high dose，＊＊P＜0.01 vs control group;▲P＜0.05 vs model group.

2.7通心絡(luò)膠囊對(duì)DCM小鼠心肌組織NF－κB核蛋白水平的影響為觀察通心絡(luò)膠囊對(duì)DMC小鼠心肌細(xì)胞核NF-κB p65表達(dá)的影響，我們采用Western blot技術(shù)檢測(cè)NF-κB p65核蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65核蛋白表達(dá)升高了238.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ;給藥12周后，與模型組比較，TXL中、高劑組NF-κB p65核蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示DCM小鼠心肌存在NF-κB信號(hào)通路的過度激活，通心絡(luò)膠囊的心肌保護(hù)作用依賴于NF-κB信號(hào)通路的抑制。見Fig 3。

Fig 3 Effects of TXL on the expression of NF-κB p65 protein in cardiac tissue(±s，n=10)

3　討論

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者由于長(zhǎng)期高血糖引起的心肌和微血管病變，是糖尿病的獨(dú)立并發(fā)癥之一。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，糖脂代謝紊亂、高胰島素血癥、胰島素抵抗、微血管病變、細(xì)胞凋亡等均是DCM發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因素，其中胰島素抵抗貫穿于糖尿病的始末，是DCM發(fā)病的的重要環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致心肌肥厚、間質(zhì)纖維化、心臟收縮和(或)舒張功能不全甚至心力衰竭［2］。研究表明胰島素抵抗對(duì)心臟功能的損害主要與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下糖脂代謝紊亂、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路異常、內(nèi)皮功能障礙及炎癥反應(yīng)有關(guān)，其中炎癥反應(yīng)是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因素。炎癥因子誘導(dǎo)胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)特定位點(diǎn)的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，抑制胰島素受體(IR)與IRS-1的相互作用，阻止IRS-1對(duì)其下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K)磷酸化的激活過程，減弱靶細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (glucose transporter 4，GLUT-4)的表達(dá)及對(duì)葡萄糖的攝取和糖原合成，最終導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生，這是炎癥因子介導(dǎo)胰島素抵抗形成的主要分子機(jī)制［5］。此外，在臨床治療中我們發(fā)現(xiàn)即使嚴(yán)格控制血糖、血脂水平也不能完全阻斷部分糖尿病患者心肌病變的進(jìn)展，我們推測(cè)DCM心肌損傷并不是糖脂代謝紊亂和心臟功能失調(diào)的直接后果，免疫炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。NF-κB是細(xì)胞中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用。基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，糖尿病心肌中白細(xì)胞和炎癥因子異常高表達(dá)，且NF-κB在炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，其中p65是NF-κB行使功能的必需亞單位［6－7］。炎癥反應(yīng)中伴有TNF-α、IL-6、CRP等細(xì)胞因子水平的異常升高，促進(jìn)血管斑塊形成和微血管病變。此外，TNF-α還可減少心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，增強(qiáng)對(duì)脂肪酸和酮體的利用，造成心肌能量代謝紊亂［8］。

KLF4是廣泛表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等靶點(diǎn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核，通過調(diào)控多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制參與細(xì)胞增殖、分化、炎癥反應(yīng)及腫瘤形成等生理和病理過程［9］。Shen等［10］研究發(fā)現(xiàn)KLF4過表達(dá)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(eNOS)的生成，具有明顯的抗炎和抗血栓作用。2014年，Yoshida等［4］研究發(fā)現(xiàn)KLF4過表達(dá)通過調(diào)控myocardin的表達(dá)和活性抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚，說明KLF4在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Yoshida等［11］研究發(fā)現(xiàn)KLF4是促炎因子激活NF-κB過程中的一個(gè)重要調(diào)控因子，特異性敲除內(nèi)皮細(xì)胞KLF4基因?qū)е翹F-κB激活和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-6等多種炎癥因子的表達(dá)和釋放，最終導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)。繼而作者采用免疫共沉淀技術(shù)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中直接觀察到KLF4 與NF-κB p65蛋白的相互結(jié)合，且導(dǎo)入KLF4基因通過抑制炎癥刺激誘發(fā)的NF-κB的激活發(fā)揮明顯的抗炎和抗增殖作用。因此，我們推測(cè)在心肌細(xì)胞KLF4同樣調(diào)控NF-κB的活化，采用藥物或siRNA阻斷這一重要環(huán)節(jié)就可以減輕TNF-α、IL-6等炎癥因子對(duì)心肌的損傷，這對(duì)于防治糖尿病及阻止DCM病理進(jìn)程具有重要意義，但具體機(jī)制有待相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。本研究在自發(fā)性糖尿病小鼠模型基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠出現(xiàn)明顯的糖脂代謝紊亂、血清TNF-α、IL-6水平、心肌組織NF-κB表達(dá)及HOMA-IR均較對(duì)照組明顯升高，KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致［11-12］，提示KLF4介導(dǎo)的NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活在胰島素抵抗及DCM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

通心絡(luò)膠囊是包含人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲，蟬蛻、赤芍等成分的中藥復(fù)方制劑，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成及改善血管內(nèi)皮功能等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于冠心病的治療［13 -14］。本研究結(jié)果顯示，通心絡(luò)膠囊可通過降低血清TG、TC含量，調(diào)節(jié)DCM小鼠脂質(zhì)代謝，減輕心肌組織病理損傷及炎癥反應(yīng)，與模型組比較，通心絡(luò)中、高劑組TNF-α、IL-6含量及NF-κB表達(dá)明顯降低，KLF4表達(dá)明顯升高，且呈劑量依賴性。本研究結(jié)果提示，通心絡(luò)膠囊可能是通過上調(diào)心肌組織KLF4表達(dá)、抑制NF-κB表達(dá)和炎癥因子的分泌和釋放改善脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。KLF4可能是通心絡(luò)膠囊發(fā)揮藥理作用的重要靶點(diǎn)之一，對(duì)KLF4在糖尿病心肌病發(fā)病中的作用進(jìn)行深入研究，有望為糖尿病心肌病的預(yù)防、早期治療及延緩疾病進(jìn)展提供新的理論依據(jù)。

(本實(shí)驗(yàn)在河北省人民醫(yī)院省老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。)

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◇研究簡(jiǎn)報(bào)◇

Expression of KLF4 in diabetic mouse myocardium and the interventional effect of Tongxinluo capsule on diabetic cardiomyopathy

ZHANG Zhe，WANG Chao
(People’s Hospital of Hebei Province，Key Laboratory of Geriatric Medicine，Shijiazhuang 050051，China)

Abstract:AimTo observe the expressions of KLF4 in the myocardium of diabetic mice and their changes under Tongxinluo capsule intervention.Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into diabetic model group(n=10) and diabetic model with Tongxinluo(TXL low，middle，high) groups(n=10，respectively).C57BL/6 mice were selected as control group (n=10).At the end of the 3th month the mice were sacrificed and were weighed.The fasting blood-glucose (FBG)，glycosylated hemoglobin(HbA1c)，triglyceride (TG)，total cholesterol (TC) and insulin(FINS) were measured to calculate HOMA-IR.Radioimmunoassay was used to measure serum TNF-α and IL-6.The pathological changes in the myocardium of mice were observed by HE staining.KLF4 mRNA was examined by Real-time PCR，while KLF4 and NF-κB protein were measured by Western blot.Results Compared to the control group，F(xiàn)BG，HbA1c，TG，TC，F(xiàn)INS，HOMA-IR，TNF-α and IL-6 in model group were markedly increased; the expressions of myocardial KLF4 were markedly decreased and the expression of nuclear NF-κB protein were markedly increased (P＜0.01).Tongxinluo capsule could significantly reduce myocardial pathological damage，F(xiàn)INS，TG，TC，TNF-α，IL-6 level and the expression of nuclear NF-κB protein and up-regulate the expression of KLF4 (P＜0.05)，but had no effect on FBG and HbA1c(P＞0.05).Conclusions KLF4 may be involved in the development of myocardial injury during diabetes.Tongxinluo capsule can ameliorate the myocardial damage and improve the function of diabetic myocardium by up-regulating the expression of KLF4 and inhibiting the activation of NF-κB inflammatory signal pathway.

Key words:Tongxinluo capsule; diabetic cardiomyopathy; Krüppel-like factor 4; blood sugar; blood lipids; NF-κB; inflammation; signal pathway

作者簡(jiǎn)介:張哲(1980－)，女，博士，助理研究員，研究方向:代謝綜合征、糖尿病、血脂紊亂和骨質(zhì)疏松等疾病發(fā)病機(jī)制，Tel:0311-85988007，E-mail: zhe_zhang80@126.com;王超(1975－)，男，博士，副研究員，研究方向:代謝綜合征、糖尿病、血脂紊亂和骨質(zhì)疏松等疾病發(fā)病機(jī)制，通訊作者，Tel:0311-85988310，E-mail:13731156811@139.com

基金項(xiàng)目:河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No C2011307008)

收稿日期:2015－02－22，修回日期:2015－04－05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015) 06－0876－06中國(guó)圖書分類號(hào): R-332; R287; R322.11; R394.2; R587.202.2; R587.201

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.027