朱 梅，任桂紅，趙桂云，孫海明，董 然，劉洪章

(1.北華大學化學與生物學院，吉林省吉林市 132013；2.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118)

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長白山復序橐吾多糖的提取及其免疫活性研究

朱 梅1，任桂紅1，趙桂云1，孫海明1，董 然2，劉洪章2

(1.北華大學化學與生物學院，吉林省吉林市 132013；2.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118)

經(jīng)90%乙醇浸泡處理的復序橐吾葉，熱水煮提，乙醇沉淀，常規(guī)干燥，得粗多糖，由理化性質(zhì)分析表明，粗多糖為不含淀粉的酸性雜多糖；粗多糖經(jīng)凍融法和酶-Sevag法聯(lián)合脫蛋白及透析處理后，通過DEAE-纖維素離子交換層析、SepharoseCL-6B凝膠柱層析分級純化，得到6個多糖級分；采用高效液相色譜法測定各級分的單糖，組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖；進一步利用高效凝膠滲透色譜法對各多糖級分的分子量分布進行了分析；應用MTT法對復序橐吾多糖免疫活性進行測定，結(jié)果表明其對小鼠脾臟T淋巴細胞的體外增殖有一定的促進作用。

復序橐吾；多糖；分離提??；理化性質(zhì)；免疫活性

復序橐吾(Ligularia jaluensis Kom.)系菊科橐吾屬植物，為多年生草本，生于海拔450～1 000m的草甸子及林緣濕地，為長白山特有種[1-2]。復序橐吾根及根莖做“紫菀”入藥，稱“山紫菀”，有潤肺、下氣、祛痰，止咳之功效[3-4]，其嫩葉是長白山區(qū)朝鮮族群眾比較喜食的山野菜種類，具有特殊的風味。

對橐吾屬植物多糖的研究，目前報道的有劉春蘭[5-6]等對大黃橐、鹿蹄橐吾水溶性多糖分離提取及其抗氧化作用的探討，其它研究還未見報道。筆者野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長白山區(qū)野生復序橐吾蘊藏量大，是值得開發(fā)利用的植物資源。本文對復序橐吾多糖進行提取分離，對其理化性質(zhì)、單糖組成及分子量分布進行分析，并探討其對T淋巴細胞體外增殖的影響，為開發(fā)利用復序橐吾資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1)復序橐吾， 采自吉林省敦化市青溝子林場，海拔約416m的林緣沼澤濕草地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學園藝學院董然教授鑒定為復序橐吾(Ligularia jaluensis Kom.)。

(2)ICR小鼠，吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

牛血清白蛋白(中國生物制品檢定所)，D-半乳糖醛酸(Sigma公司進口分裝) ,考馬斯亮藍G-250 (北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)，DEAE-纖維素(Waterman公司)，SepharoseCL-6B凝膠(Pharmcia公司)，噻唑藍(MTT)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Amersco)，刀豆蛋白(ConA, Gibco)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司)，冷凍干燥機(EYELA公司)，TGL-16A高速臺式離心機(蘇州奇樂電子科技有限公司)，TSK-gel-G3000PWXL (TOSOH)，LC-10Avp高效液相色譜儀(Shimadzu)，3550-UV 酶標儀(Bio-Rad公司),MCO-15ACCO2培養(yǎng)箱(日本三洋), 紫外可見分光光度計(Biochrom公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 復序橐吾粗多糖的提取

稱取干燥的經(jīng)90%乙醇浸泡處理的復序橐吾葉250g，加入蒸餾水2.5L浸泡過夜，在保持90～100℃的條件下，熱水煮提，間隙攪拌，每次30min，120目尼龍布過濾，殘渣重復上述方法繼續(xù)提取2次，合并3次濾液，濾液減壓濃縮至一定體積，經(jīng)80℃水浴濃縮至終體積為400mL，離心(4000rpm，10min)，棄沉淀，上清液用無水乙醇按1∶4比例醇沉，置4℃冰箱中24h，離心，取沉淀，沉淀依次用無水乙醇、乙醚洗滌3次, 置于真空干燥箱中干燥，得復序橐吾粗多糖(CLJP)。

1.3.2 脫蛋白與透析

利用反復凍融、酶法和Sevag法聯(lián)合除蛋白[7]，將脫蛋白后的粗多糖溶液，置入截留分子量為1000的透析袋內(nèi)，去離子水透析48h，鹽和小分子物質(zhì)不斷擴散透析到袋外，樣品液經(jīng)冷凍后得復序橐吾脫蛋白多糖(LJP)。

1.3.3 復序橐吾多糖的分級純化

(1)DEAE-纖維素柱層析：采用DEAE-Cellulose52 (OH-)柱層析，濕法裝柱(2.6cm×40cm)，平衡后上樣。取復序橐吾多糖(LJP)40g溶于400mL溶于去離子水中，上樣于平衡好的DEAE-52纖維素柱，依次用去離子水和0.5M NaC1溶液進行分級洗脫，流速為5mL·min-1，收集洗脫液(10mL/管)，以硫酸-苯酚法在490mm波長下跟蹤檢測糖含量，分別收集不同的洗脫峰，獲得去離子水洗脫級分和NaCl溶液洗脫級分。

(2)SepharoseCL-6B柱層析：將從DEAE-52纖維素柱層析得到的水洗脫級分和0.5 M NaCl溶液洗脫級分，離心(10000rpm，3min)，上清液經(jīng)SepharoseCL-6B(2.6cm×100cm)柱層析制備柱繼續(xù)分級，上樣2.0mL(20 mg·mL-1)，用0.15M的NaCl洗脫，洗脫速度為1.0mL·min-1，BS-100A自動部分收集器收集洗脫液(每管20mL)，以硫酸-苯酚法檢測每管多糖含量，以洗脫管數(shù)為橫坐標、吸光度(波長490nm處測定)為縱坐標繪制洗脫曲線，合并糖峰洗脫液，減壓凍干。

1.3.4 理化性質(zhì)研究

(1)總糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[8]，以葡萄糖為標準糖樣繪制標準曲線。

(2)淀粉含量測定：采用KI-I2法[9]，以可溶性淀粉為標準繪制標準曲線。

(3)糖醛酸含量測定：采用硫酸-咔唑比色法[10-11]，以半乳糖醛酸為標準糖醛酸繪制標準曲線。

(4)蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮藍法[12]，以牛血清白蛋白為標準蛋白繪制標準曲線。

(5)單糖組成分析：采用PMP衍生化和高效液相色譜(HPLC)法[13]，分析多糖的單糖組成。

(6)多糖分子量分布測定：高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法，采用LC-10Avp高效液相色譜儀系統(tǒng)，按色譜條件，測定洗脫體積，按公式(1-1)計算分配系數(shù)(Kav)，以Kav為縱坐標，用不同分子量的葡聚糖標準品(1.0mg·mL-1)，以其分子量的對數(shù)lgMw為橫坐標繪制標準曲線。

Kav=Ve-Vo/Vt-Vo

(1-1)

其中，Ve為待測樣品的糖峰洗脫體積，Vo為凝膠柱的外水體積，Vt為凝膠柱的總體積。

在相同條件下，將LJP用0.2M NaCl配制成2mg·mL-1的溶液，使用0.45μm 的微孔濾膜過濾，上樣量20μL，流動相為0.2mol·L-1NaCl溶液，流速0.6mL·min-1，測定洗脫體積。

1.3.5 體外免疫活性測定方法

選擇體重18～20g的昆明小鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精消毒，無菌取脾，研磨制備脾細胞懸液，用0.01% Tris-NH4Cl溶解紅細胞， RPMI-1640沖洗1次，以含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成1×107mL-1的細胞懸液，加入96孔板中，每孔100μL；實驗孔中分別加入不同稀釋濃度的多糖樣品，使其終濃度分別為200μg·mL-1、20μg·mL-1、2μg·mL-1、0.2μg·mL-1，每一實驗組均加入ConA(終濃度2.5μg·mL-1)；另設(shè)細胞對照組、ConA對照組(終濃度2.5μg·mL-1)、空白對照組，每孔加入液體終體積為200μL，每組設(shè)3個復孔。5%CO2培養(yǎng)箱中(37℃)培養(yǎng)44h后，每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)，培養(yǎng)4h，離心5min(1000rpm)，吸去上清，加入200μL DMSO，充分振蕩 1min，酶標儀(λ595)測定吸光度值，計算刺激指數(shù)(SI)：

SI = 實驗組的A595nm- 空白對照的A595nm/ 細胞對照的A595nm- 空白對照的A595nm

采用t檢驗方法統(tǒng)計分析，檢測數(shù)據(jù)用±SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 復序橐吾粗多糖的提取及其理化性質(zhì)

按“1.3.1”的方法，得到棕褐色粉末狀復序橐吾粗多糖(CLJP)51.33g，得率為20.53%，CLJP易溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑。經(jīng)乙醇的處理可除去單脂類、多肽、色素、寡糖、有機酸等小分子物質(zhì)，提高多糖純度。CLJP總糖含量為23.24%，蛋白質(zhì)含量為1.10%，糖醛酸含量為19.20%?？梢?，CLJP由中性和酸性多糖組成；而采用KI-I2法對淀粉含量測定，結(jié)果顯示CLJP不含淀粉。

本實驗方法與文獻[5-6]比較，綜合能耗、時間等因素考慮，筆者認為適度的熱水煮提，時間短、耗能低，提取率高，適合對橐吾多糖的提??；此外，還可以推測，橐吾屬植物多糖是不含淀粉的酸性雜多糖，但種類、地域、來源、植物部位及提取方法不同會導致其蛋白質(zhì)含量差別較大。

CLJP經(jīng)凍融法和酶-Sevag法聯(lián)合脫蛋白及透析處理，冷凍干燥，得脫蛋白多糖(LJP)，得率為26.70%；對其總糖含量、糖醛酸含量進行測定，分別為65.25%、37.60%，表明粗多糖經(jīng)除蛋白和鹽分后，總糖含量和糖醛酸含量明顯增加。

采用PMP衍生化和HPLC法，測得LJP由Man、Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Ara7種單糖組成(圖1)，各單糖摩爾比為3.5∶1∶2∶7∶6.6∶9.7∶4.7，其中Gal、GalUA、Glc、Ara含量較高。

圖1 LJP的HPLC色譜圖

根據(jù)標準葡聚糖的分子量Mw和測得的Ve、Vo和總體積 Vt,按公式(1-1)計算 Kav,以 Kav 為縱坐標，lg Mw為橫坐標得到標準曲線及回歸方程Kav=-0.188X+1.0341, R2=0.9916。 對LJP進行HPGPC 分析顯示(圖2)，LJP分子量范圍在110～470000Da，說明其分子量分布較寬，且中等分子量多糖(1270，2760，110000，470000Da)較多。

圖2 LJP HPGPC色譜圖

2.2 LJP的分級純化及各級分單糖組成、分子量分布分析

從DEAE-纖維素離子交換層析得到水和0.5M NaCl溶液洗脫級分兩部分，然后分別通過SepharoseCL-6B凝膠層析繼續(xù)分級得到LJPN1，LJPN2，LJPN3；LJPA1，LJPA2，LJPA3共6個多糖級分(圖3)。

圖3 Sepharose CL-6B柱層析洗脫曲線

對各多糖級分的單糖組成及按峰面積計算各單糖的百分含量分析顯示，6個多糖級分由Man、Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Ara、Fuc、Xyl組成，各多糖級分中含量較高的單糖組分分別是LJPN1：Gal(32.35%)，GalA(23.85%)，Ara(20.18%)；LJPN2：GalA(40.14%)，Gal(19.88%)，Ara(16.77%)；LJPN3：GalA(43.50%)，Glc(15.38%)；LJPA1：Glc(22.89%)，Gal(21.59%)，GalA(19.14%)，Ara(16.45%)；LJPA2：Glc(44.04%)，GalA(16.96%)；LJPA3：Rha(14.51%)，GluA(9.85%)。此外，各級分酸性糖含量較高，原因可能是在正常情況下，中性多糖不被DEAE-纖維素吸附，被水洗脫下來，而酸性多糖則被DEAE-纖維素吸附，在吸附能力許可的范圍內(nèi)，洗脫液中只能檢出微量的糖醛酸。但當上樣量超量時，超過了DEAE-纖維素的吸附能力，洗脫液中糖醛酸的含量會明顯增多，因此造成水洗脫級分的糖醛酸含量也較高。

通過HPGPC分析表明，LJPA3在TSK-gel-G3000PWXL凝膠層析上呈現(xiàn)單一對稱峰，分子量為5 159Da，分子量相對均一；其它多糖級分呈現(xiàn)出2～3個峰，分子量在416～473 168Da之間，由2～3個不同分子量級分組成(圖4)。

圖4 LJPN1-3和LJPA1-3的HPGPC圖譜

多糖的性質(zhì)往往和它的分子量大小有關(guān)，且對多糖的生物活性也有影響，因此，多糖分子量測定是多糖研究的一項重要內(nèi)容。通過對6個級分的分子量分布進行比較可見，本實驗得到的各多糖級分基本為單一組分多糖或較窄分子量范圍的多糖。

2.3 復序橐吾多糖對小鼠T淋巴細胞體外增殖的影響

實驗結(jié)果表明，CLJP、LJPA3、LJPN1對ConA誘導的小鼠脾臟T淋巴細胞的體外增殖具有協(xié)同促進效應，且呈劑量依賴性(圖5)。200μg·mL-1的CLJP、LJPA3、LJPN1均可顯著增加ConA誘導的小鼠T淋巴細胞的增殖，與細胞對照組相比，各組P<0.05；20μg·mL-1的LJPA3、2μg·mL-1的LJPN1也可促進ConA誘導的小鼠T淋巴細胞增殖，但P>0.05。

圖5 CLJP、LJPA3、LJPN1對小鼠T淋巴細胞增殖的影響

研究表明，植物多糖可以通過激活T、B淋巴細胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和NK 細胞等免疫細胞，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[15]，所以植物多糖作為生物免疫調(diào)節(jié)劑已越來越被人們所重視。因此，在本實驗的基礎(chǔ)上，可以繼續(xù)進行體內(nèi)試驗，為復序橐吾多糖在免疫調(diào)節(jié)方面的應用提供實驗依據(jù)。

[1]江蘇新醫(yī)學院,中藥大詞典(上、下冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1977:154,1152,2349.

[2]中國科學院北京植物研究所,中國高等植物圖鑒:第四冊[M].北京:科學出版社,1975:576-589.

[3]張達治,余國奠,張勉,等.橐吾屬植物藥用研究概況[J].中國野生植物資源,2003,22(2):4-7.

[4]劉尚武.中國植物志(第77卷第2分冊)[M].北京:科學出版社,1989:55-103.

[5]劉春蘭,周博,杜寧,等.大黃橐吾水溶性多糖的初步純化及清除自由基活性研究[J],中央民族大學學報:自然科學版, 2007,16(4):341-345.

[6]劉春蘭,杜寧,徐桂云,等.鹿蹄橐吾多糖LW21 的分離純化及其結(jié)構(gòu)分析[J].食品科學，2012,33(11):57-61.

[7]李永裕.余甘多糖分離純化、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2010.23-24.

[8]Michel dubois,k.a.gilles,j.k.hamilton,p.a.rebers,and fred smith,colorimetric method for determinea tion of sugars and related substances,analytical chemistry,1956,28(3):350-356.

[9]徐昌杰,陳文峻,陳昆松,等.淀粉含量測定的一種簡便方法-碘顯色法[J].生物技術(shù),1998,8(2):41-43.

[10]王文平,郭杞遠,李琳,等.野木瓜多糖中糖醛酸含量測定[J].,食品科技,2007,32(10):84-86.

[11]夏永剛,梁軍,楊炳友,等.麻黃多糖中糖醛酸含量的測定[J].中醫(yī)藥學報,2011,39(1):71-73.

[12]Bradford MM,Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976(72):248-254.

[13]Strydom D J.Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl·Spyrazolone—derivatized neural, acidicand basic aldoses[J].Journal ofChromatography A,1994(678):17-23.

[14]金春雁,張衛(wèi)明,顧龔平,等.藥用植物多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性[J].中國野生植物資源,2005,24(1):15-18.

Study on the Extraction and Immunological Activity of Polysaccharides from Ligularia jaluensis in Changbai Mountains

ZHU Mei1,REN Gui-hong1,ZHAO Gui-yun1,SUN Hai-ming1,DONG Ran2,LIU Hong-zhang2

(1. School of Chemistry and Biology,Beihua University, Jilin Jilin 132013, China；2.School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun Jilin 130118, China)

Ligularia jaluensis leaves were soaking treated by 90% ethanol, then Crude polysaccharide were obtained by hot aqueous extraction, ethanol precipitation and conventional desiccation. Phisicochemical property analysis indicated that Ligularia jaluensis crude polysaccharide was acidic heteropolysaccharide without starch. 6 polysaccharide fractions were obtained via fractionation purification of deae-cellulose and SepharoseCL-6B Gel chromatography after deproteinzation through combination of freeze-thaw method and enzyme-Sevag method and dialysis. Monosaccharide composition of each polysaccharide fraction was determined by HPLC to consist of mannose, rhamnose, glucuronic acid, galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, xylose and fucose. MWD of each polysaccharide fraction were analysed further by HPGPC. The result of determination of immunological competence manifested that Ligularia jaluensis polysaccharide showed some auxo-action to mice T-cell proliferation in vitro.

Ligularia jaluensis；polysaccharides；separation and extraction; physicochemical property; immunological activity

2015-05-16

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20100254)；吉林省教育廳科學技術(shù)研究項目(2012138)。

朱 梅(1963- )，女，吉林樺甸人，北華大學化學與生物學院副教授，博士，從事藥用植物資源學研究。

劉洪章(1958- )，男，吉林長春人，教授，博士生導師，從事長白山野生經(jīng)濟植物種質(zhì)資源研究。

Q539

A

2095-7602(2015)10-0066-05