田志鵬，孟亮，楊帆，李立杰，王微

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 循環(huán)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng)110024）

MicroRNA（簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA）是一類(lèi)生物進(jìn)化上高度保守、長(zhǎng)度為21～26個(gè)核苷酸的非編碼核苷酸的單鏈小分子RNA，在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守，其并不編碼蛋白質(zhì)，但通過(guò)對(duì)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯及靶RNA穩(wěn)定性的調(diào)控，參與到許多重要的生物過(guò)程中。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，使miRNA成為心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。國(guó)外研究表明，miRNA-1在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者外周血中明顯增高，可能成為診斷AMI新的生化標(biāo)記物[1-3]。

急性心肌梗死是一種發(fā)病迅速、死亡率高的常見(jiàn)病，部分心肌梗死的早期癥狀不典型，心電圖表現(xiàn)不明顯。為了降低AMI的死亡率，急切需要一種早期且更加特異的診斷AMI的新型的生化標(biāo)記物。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，通過(guò)檢測(cè)急性心肌梗死患者和健康人群血清中MicroRNA-1（簡(jiǎn)稱(chēng)miR-1）表達(dá)量的差異，探討血清miR-1作為急性心肌梗死早期診斷生化標(biāo)記物的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 心肌梗死組患者 選擇2012年10月-2013年12月沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院循環(huán)內(nèi)科收治的急性心肌梗死患者49例。入選標(biāo)準(zhǔn)：心肌梗死患者參照2010年心肌梗死診斷指南。心臟生物標(biāo)志物至少有1次數(shù)值超過(guò)參考值上限的99百分位（即正常上限），并有以下至少1項(xiàng)心肌缺血的證據(jù)：①心肌缺血臨床癥狀；②心電圖出現(xiàn)新的心肌缺血變化，即新的ST段改變或左束支傳導(dǎo)阻滯；③心電圖出現(xiàn)病理性Q波；④影像學(xué)證據(jù)顯示新的心肌活力喪失或區(qū)域性室壁運(yùn)動(dòng)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)其他臟器功能衰竭或嚴(yán)重病變（如肺癌、肝和腎功能衰竭等）及過(guò)敏性疾病和自身免疫性疾病的患者除外。

1.1.2 健康組入選標(biāo)準(zhǔn) 無(wú)心血管病史，心電圖、胸片、肝腎功能和生化常規(guī)檢查正常，排除合并感染和腫瘤等。

1.1.3 采血時(shí)間 所有患者（包括疑是心肌梗死患者）入院后即留取血液樣本，之后根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)中2010年急性心肌梗死診斷指南，符合急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)則入選本實(shí)驗(yàn)。以心肌梗死典型癥狀出現(xiàn)作為0點(diǎn)，每次采血時(shí)間與心肌梗死典型癥狀出現(xiàn)時(shí)間間隔確定為此次采血時(shí)間段。入院時(shí)間（首次采血時(shí)間）在心肌梗死典型癥狀發(fā)作后8 h內(nèi)則入選本研究，在8 h以上則剔除入選本研究。除了T0以后所有的時(shí)間點(diǎn)，在每一個(gè)患者都是按照試驗(yàn)預(yù)定時(shí)間采血。此研究符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 在心肌梗死發(fā)作后的不同時(shí)間段收集全血標(biāo)本（4ml×2）。T0：AMI患者入院時(shí)（4.98±2.46）h；T8：AMI發(fā)病8 h（8.00±0.50）h；T12：AMI發(fā)病12 h（12.00±0.50）h；T24：AMI發(fā)病24 h（24.00±0.50）h；7 d：AMI發(fā)病后第7天；14 d：AMI發(fā)病后第14天。其中一份用于提取全血RNA，另一份血液標(biāo)本離心機(jī)（Sigma公司）離心10 min（1 000 r/min），吸取上清液，用于檢測(cè)肌鈣蛋白I（troponin I，cT nI）。血漿與全血標(biāo)本均保存于-80℃冰箱（Thermo公司）中。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血漿cTnI的表達(dá) 根據(jù)ELISA（Abnova，臺(tái)灣）試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)樣本中cTnI的表達(dá)量。

1.2.3 RNA分離及實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）Trizol提取全血總RNA（Invitrogen，CA）。取2μg總RNA根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（Promega，WI），選用U6作為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下：miR-1 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGA GTCGGCAATTGCACTGGATACGACTACATAC-3'；U6：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Biosystems，CA），ABI7000實(shí)時(shí)定量PCR儀（Biosystems，CA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。RT-PCR反應(yīng)引物序列如下：miR-1上游引物序列5'-GGGGTG GAATGTAAAGAA-3'，下游引物序列5'-TGCGTGTC GTGGAGTC-3'；U6：上游引物序列5'-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列5'-CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。每個(gè)樣本均設(shè)復(fù)孔。反應(yīng)體系95℃孵育30 s后開(kāi)始循環(huán)程序：變性95℃，15 s，退火60℃，60 s，延伸60℃，60 s共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用ABI 7000軟件進(jìn)行分析，將qRT-PCR中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）作為樣本表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用2-△△Ct方法計(jì)算miR-1的相對(duì)表達(dá)水平，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量數(shù)據(jù)用方差齊性檢驗(yàn)以及t檢驗(yàn)，兩兩間比較用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用ROC曲線(xiàn)來(lái)判定miR-1對(duì)急性心肌梗死的診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選對(duì)象的基線(xiàn)特征

AMI組患者49例，對(duì)照組49例，各組入選對(duì)象年齡、性別、吸煙人數(shù)、心率（heart rate，HR）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP） 和 舒 張 壓（diastolic blood pressure，DBP）基線(xiàn)特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)附表。

2.2 全血m iR-1在急性心肌梗死發(fā)病不同時(shí)間的表達(dá)量

圖1為全血miR-1相對(duì)表達(dá)水平，miR-1的相對(duì)表達(dá)量用log2miR表達(dá)率表示，其值越低，miR表達(dá)量越高。全血miR-1在急性心肌梗死發(fā)病后的表達(dá)量都較對(duì)照組增高，在T0[入院時(shí)（4.98±2.46）h]、T8[AMI發(fā)病8 h，（8.00±0.50）h]、T12[AMI發(fā)病12 h，（12.00±0.50）h]和T24[AMI發(fā)病24 h，（24.00±0.50）h]時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 全血m iR-1相對(duì)表達(dá)水平

附表 入選病例基線(xiàn)特征 （n=19，±s）

附表 入選病例基線(xiàn)特征 （n=19，±s）

組別 年齡/歲 男性/［例（%）］ 吸煙人數(shù)/［例（%）］高血壓/［例（%）］高脂血癥/［例（%）］糖尿病/［例（%）］ HR/（次/min） SBP/mmHg AMI組 52.11±11.42 28（57.1） 27（55.1） 20（40.8） 27（55.1） 18（36.7） 86.28±10.16 133.47±5.84對(duì)照組 53.08±8.70 27（55.1） 24（49.0） 15（30.6） 20（40.8） 14（28.6） 81.89±9.05 131.86±5.01 P值 0.850 0.841 0.549 0.297 0.160 0.394 0.342 0.498

續(xù)附表

2.3 在急性心肌梗死發(fā)病不同時(shí)間全血m iR-1與cTn I表達(dá)量的對(duì)比

在全血miR-1相對(duì)表達(dá)水平與血漿cTnI表達(dá)水平的對(duì)比圖（見(jiàn)圖2）中可以看出，全血miR-1在AMI患者入院時(shí)即開(kāi)始增高，在發(fā)病8 h達(dá)峰值，T24之后有所下降，7 d降至正常范圍；cTnI在AMI患者入院時(shí)即開(kāi)始增高，在發(fā)病24 h達(dá)峰值，T24之后有所下降，7 d降至正常范圍。miR-1與cTnI比較具有更早的達(dá)峰值時(shí)間。

2.4 血清m iR-1預(yù)測(cè)AMI的評(píng)估

血清miR-1的ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）在T0（A）、T12（B）和T24（C）分別為0.888（95%置信區(qū)間CI：0.812～0.964，P=0.001）、0.906（95%置信區(qū)間CI：0.839～0.974，P=0.001）和0.838（95%置信區(qū)間CI：0.745～0.931，P=0.001）。結(jié)果提示血清miR-1診斷AMI具有較高的敏感性和特異性。見(jiàn)圖3。

圖2 全血m iR-1相對(duì)表達(dá)水平與血漿cTn I表達(dá)水平

圖3 血清m iR-1診斷價(jià)值的評(píng)估

3 討論

部分AMI患者的早期癥狀不典型，心電圖表現(xiàn)不明顯，如何盡早診斷AMI一直是困擾臨床醫(yī)生的難題之一。目前用于診斷AMI的生化指標(biāo)主要有肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T和肌紅蛋白等，但它們?cè)缙谠\斷AMI卻不很理想，肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T缺乏早期敏感性；肌紅蛋白對(duì)骨骼肌和心肌損傷不能區(qū)分，缺乏特異性。所以急切需要一種早期，更加特異的診斷AMI的新型的生化標(biāo)記物。

miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼RNA，在抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)和促進(jìn)靶mRNA降解的過(guò)程中起重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白的表達(dá)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能。迄今在心肌細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種miRNA，如microRNA-1、microRNA-21、microRNA-133和micro RNA-195等，它們參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的miRNA與心肌損傷密切聯(lián)系。在AMI早期1～2 h即可測(cè)得miRNA改變[4-7]，而且miRNA具有細(xì)胞特異性和在血漿、血清和尿液中的穩(wěn)定性，正在逐漸成為診斷AMI的一種新型的生化標(biāo)記物。目前國(guó)外有關(guān)miRNA在AMI早期診斷中應(yīng)用的研究結(jié)果表明[8-11]，miRNA與傳統(tǒng)的生化指標(biāo)相比較，在時(shí)效性、敏感性和特異性上具有綜合優(yōu)勢(shì)，是一種新的、有重要價(jià)值的AMI診斷指標(biāo)。

miR-1是肌肉及心肌組織中富含的一種miRNA。CHENG等[12]在Triton X-100體外誘導(dǎo)的心肌壞死模型中發(fā)現(xiàn)，miR-1能釋放入培養(yǎng)液中，且能穩(wěn)定存在至少24 h。D'ALESSANDRA等[13]的研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者循環(huán)中的miR-1的上調(diào)與cTnI水平相關(guān)，具有相同的峰值時(shí)間。提示miR-1可能作為AMI新的生化標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)全血miR-1在急性心肌梗死發(fā)病后的表達(dá)量增高，在T0、T8、T12和T24均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。這與國(guó)外研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果提示miR-1在AMI患者發(fā)病8 h達(dá)峰值，而cTnI在AMI患者發(fā)病24 h達(dá)峰值，說(shuō)明miR-1具有早期診斷AMI的優(yōu)勢(shì)。miR-1的ROC曲線(xiàn)下面積在T12為0.906，提示miR-1診斷AMI具有較高的敏感性和特異性。本研究提示未來(lái)血清miR-1可能成為急性心肌梗死早期診斷的新的生化標(biāo)記物。

[1]FIC P,KOWALCZUK K,GRABARSKA A,et al.MicroRNA--a new diagnostic tool in coronary artery disease and myocardial infarction[J].Postepy Hig Med Dosw,2014,68:410-418.

[2]SAYED AS,XIA K,SALMA U,et al.Diagnosis,prognosis and therapeutic role of circulating miRNAs in cardiovascular diseases[J].Heart Lung Circ,2014,23(6):503-510.

[3]HUANG S,CHEN M,LI L,et al.Circulating MicroRNAs and the occurrence of acute myocardial infarction in Chinese populations[J].Circ Cardiovasc Genet,2014,7(2):189-198.

[4]SAYED AS,XIA K,YANG TL,et al.Circulating microRNAs:a potential role in diagnosis and prognosis of acute myocardial infarction[J].Dis Markers,2013,35(5):561-566.

[5]XIAO J,SHEN B,LI J,et al.Serum microRNA-499 and microRNA-208a as biomarkers of acute myocardial infarction[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(1):136-141..

[6]MATSUMOTO S,SAKATA Y,NAKATANI D,et al.A subset of circulating microRNAs are predictive for cardiac death after discharge for acute myocardial infarction[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,427(2):280-284.

[7]LI C,PEI F,ZHU X,et al.Circulating microRNAs as novel and sensitive biomarkers of acute myocardial Infarction[J].Clin Biochem,2012,45(10-11):727-732.

[8]RECCHIONI R,MARCHESELLI F,OLIVIERI F,et al.Conventional and novel diagnostic biomarkers of acute myocardial infarction:a promising role for circulating microRNAs[J].Biomarkers,2013,18(7):547-558.

[9]MATSUMOTO S,SAKATA Y,SUNA S,et al.Circulating p53-responsive microRNAs are predictive indicators of heart failure after acute myocardial infarction[J].Circ Res,2013,113(3):322-326.

[10]OLIVIERI F,ANTONICELLI R,LORENZI M,et al.Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction[J].Int J Cardiol,2013,167(2):531-536.

[11]WANG R,LI N,ZHANG Y,et al.Circulating microRNAs are promising novel biomarkers of acute myocardial infarction[J].Intern Med,2011,50(17):1789-1795.

[12]CHENG Y,TAN N,YANG J,et al.A translational study of circulating cell-free microRNA-1 in acute myocardial infarction[J].Clin Sci(Lond),2010,119(2):87-95.

[13]D'ALESSANDRA Y,DEVANNA P,LIMANA F,et al.Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction[J].Eur Heart J,2010,31(22):2765-2773.