于洋，柳春

（1.遼寧醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 生理學教研室，遼寧 錦州121001；2.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 生化教研室，遼寧 沈陽110032）

卵巢顆粒細胞（granulosa cell，GC）在生殖過程中起著至關(guān)重要的作用。在動物體內(nèi)，GC既可以營養(yǎng)著卵母細胞，同時又能夠促進卵母細胞的發(fā)育和成熟。因此，顆粒細胞的增殖分泌功能與卵母細胞的生長和成熟有著非常密切的關(guān)系，兩者可以形成功能上的一個整體[1]。研究表明，在哺乳動物的生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）的存在，提示NGF在生殖細胞的分化、發(fā)育和生理功能的維持方面具有重要的作用[2]。與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似的5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU），能摻入到S期細胞的DNA合成過程中，摻入合成的程度越強，顯示細胞增殖的能力越強，另外還能避免以往應(yīng)用氚標記的胸腺嘧啶核苷（thymidine，3H-TdR）檢測對細胞的放射性損害[3]。細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，經(jīng)活細胞線粒體脫氫酶還原后生成的黃色甲臜產(chǎn)物，具有高度水溶性，不需要有機溶劑裂解細胞就能夠直接進行檢測，操作步驟簡便，靈敏度高，細胞毒性小。

為了進一步驗證NGF的促生殖作用并探索其機制，同時建立一種更有效的卵巢GC體外培養(yǎng)的標記方法，本研究采用分離和培養(yǎng)原代小鼠卵巢腔前顆粒細胞（preantral granulosa cells，PreGC），應(yīng)用CCK-8分析和BrdU體外標記檢測細胞增殖，以探討NGF是如何影響GC的增殖。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

NGF，RD systems公司；DMEM-F12培養(yǎng)液，Tryple，胎牛血清，雙抗，GIBCO公司；BSA，Biotech BASIC INC公司；抗體，Promega公司；CCK-8，Dojindo laboratories公司；BrdU，BrdU in situ defection kitⅡ，BD Biosciences公司。

1.2 實驗動物

10 d齡的健康雌性ICR小白鼠，中國科學技術(shù)大學生命科學學院實驗動物中心[許可證號：SCXK（皖）2005-0008]。

1.3 PreGC的原代培養(yǎng)

小鼠斷頸處死后無菌取出雙側(cè)卵巢，去除周圍脂肪組織及卵巢被膜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗凈卵巢上血污，體視顯微鏡下用尖頭鑷子分離腔前卵泡，消化膜細胞5～10min后吸取單個腔前卵泡，2 000 r/min離心5min，棄上清液，加入胰酶消化15min，期間吹打數(shù)次，終止消化后離心5min，1 500 r/min，去上清，加入完全培養(yǎng)基制成顆粒細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105個/ml，預(yù)接種到培養(yǎng)板中。

1.4 CCK-8檢測細胞的增殖

將細胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，設(shè)定NGF分別作用時間為12、24、48、72和96 h的實驗組，每個時間段都設(shè)定各自的對照組，對照組加入普通培養(yǎng)基，每組設(shè)定6個復(fù)孔。5%二氧化碳CO2，37℃孵箱培養(yǎng)24 h，細胞貼壁率達到90%，更換含0.1%BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓24 h，加入NGF使終濃度為50 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)各個時間段后終止培養(yǎng)，PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h，酶標儀檢測450 nm波長的吸光值，計算平均值。

1.5 BrdU體外標記GC增殖

將蓋玻片（1.5 cm×1.5 cm）在酒精燈上迅速過火后小心放入24孔培養(yǎng)板中，然后將單細胞懸液滴到玻片上，40μl/滴，然后加培養(yǎng)基到500μl，設(shè)定對照組和NGF組（50 ng/m l），每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，饑餓后加入NGF使終濃度為50 ng/ml繼續(xù)培養(yǎng)。

根據(jù)細胞生長狀況，培養(yǎng)36 h左右適時取出爬片，按照BrdU免疫熒光技術(shù)的步驟操作，Hoechst染核，封片后熒光顯微鏡拍照，隨即計數(shù)10個高倍視野中細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)，計算標記指數(shù)（labeling index，LI，百分數(shù)表示）。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 NGF對小鼠卵巢PreGC促增殖作用

50 ng/m l的NGF作用PreGC不同時間段后，采用CCK-8法檢測NGF對細胞增殖的作用。結(jié)果顯示，在波長450 nm時，OD值隨作用時間的延長（12～96 h）而增加，當NGF作用48 h時，促增殖作用明顯表現(xiàn)出來，同對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），隨著NGF作用時間進一步延長，促增殖作用持續(xù)存在，同對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 BrdU的免疫熒光技術(shù)檢測及LI（%）

BrdU免疫熒光技術(shù)檢測顯示，經(jīng)50 ng/m l NGF處理36 h后，NGF對小鼠卵巢PreGC已經(jīng)有促增殖作用，見圖2。隨機計數(shù)10個高倍視野中細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)，計算LI（%），NGF組的BrdU的LI為45.03%，明顯高于對照組20.65%（P<0.01），見圖3。

圖1 不同孵育時間NGF對小鼠卵巢PreGC促增殖作用

圖2 NGF刺激小鼠卵巢PreGC 36 h后BrdU免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果 （×40）

圖3 NGF對BrdU陽性PreGC標記指數(shù)的影響

3 討論

顆粒細胞是卵巢的主要組成細胞，為卵母細胞的發(fā)育提供其所需要的營養(yǎng)物質(zhì)以及生存的微環(huán)境[4]。卵母細胞通過縫隙連接從周圍的顆粒細胞中攝取各種營養(yǎng)因子，使卵母細胞的代謝需要得以滿足。因此，顆粒細胞在卵母細胞生長中起著重要的營養(yǎng)作用[5]。而且，顆粒細胞與卵母細胞之間的縫隙連接是卵母細胞生長、分裂和成熟能夠正常進行的必需因素；同時，卵母細胞對卵泡細胞功能起著中心調(diào)節(jié)作用[6]。卵母細胞分泌的生長因子對顆粒細胞和卵丘細胞的分化、增生、凋亡和泛素化起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，說明顆粒細胞和卵母細胞之間的關(guān)系是相互依賴的[7]。顆粒細胞的增殖和分化在原始卵泡形成啟動以及以后的卵泡正常發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。因此，顆粒細胞是否能夠正常的增殖分化可作為卵泡發(fā)育成熟的標志[8]。

最開始的研究顯示：NGF的生物學功能僅僅限于神經(jīng)系統(tǒng)，但越來越多的證據(jù)表明NGF也可以作用于其他非神經(jīng)系統(tǒng)的組織細胞。研究表明，NGF及其受體TrkA和p75在動物的生殖系統(tǒng)中有表達[9]。在豬卵巢中，NGF及其受體在膜細胞和顆粒細胞中都有表達，從而證明NGF及其受體在卵泡發(fā)育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金倉鼠的子宮組織中，NGF及其受體TrkA在子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺細胞及基質(zhì)細胞中都有表達，而p75只在子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺細胞中有表達[11]。對山羊的研究顯示NGF及其受體TrkA與p75在輸卵管壺腹部與峽部的上皮細胞與肌細胞中有表達[12]。對小鼠和人的卵巢研究也表明，NGF的過表達會導致卵巢中初級卵泡與次級卵泡數(shù)量的大幅增加，而裸露的卵母細胞數(shù)量相對減少，表明不正常的NGF及其受體水平的增加會造成卵巢囊狀疾病[13]。

CCK-8試劑中含有WST-8，它是一種類似于MTT的化合物，在電子載體的作用下被細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。與傳統(tǒng)的MTT檢測法比較，CCK-8具有使用方便，不需要放射性同位素和有機溶劑，檢測快速，靈敏度高，甚至可以測定較低的細胞密度，重復(fù)性優(yōu)于MTT，對細胞毒性小等各種優(yōu)點[14]。

本實驗采用CCK-8試劑盒比較了不同作用時間的NGF對體外培養(yǎng)的小鼠PreGC增殖的影響，選取10 d齡的小鼠，獲取PreGC，避免分化的顆粒細胞自身因素對NGF促增殖作用的影響，并且在加入NGF前用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，減少其他因素干擾細胞增殖。實驗結(jié)果證實50 ng/ml的NGF作用顆粒細胞48 h的時候，促增殖作用非常明顯地表現(xiàn)出來，隨著作用時間延長，呈現(xiàn)一定的時效關(guān)系。雖然NGF對細胞的促增殖作用持續(xù)存在，但過長的作用時間可能會使細胞的密度太大。因此，判定50 ng/ml的NGF對顆粒細胞的促增殖作用最理想反應(yīng)時間不能超過48 h。

BrdU作為胸腺嘧啶的類似物，能取代胸腺嘧啶被增殖細胞利用。當細胞處于DNA合成期，即細胞處于增殖期，BrdU被細胞特異性地攝入細胞核摻入到細胞新合成的DNA中，只要細胞存活，這種存留是永久的，用抗BrdU單克隆抗體經(jīng)免疫熒光技術(shù)染色后，可特異性顯示BrdU陽性標記細胞，即可直接觀察其在細胞內(nèi)的摻入情況[15]。

本研究采用BrdU體外標記方法，50 ng/m l的NGF作用顆粒細胞36 h后，進行免疫熒光技術(shù)檢測，結(jié)果顯示熒光顯微鏡下可見BrdU陽性標記的顆粒細胞，NGF組的陽性細胞數(shù)量明顯多于對照組，提示細胞處于增殖期。同時計算BrdU陽性標記指數(shù)LI（%），數(shù)據(jù)顯示NGF組的BrdU標記指數(shù)明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，這更加直觀的表明NGF能夠促進顆粒細胞的增殖。

可見，在研究NGF促顆粒細胞增殖及影響因素實驗中，采用CCK-8檢測和BrdU體外標記的方法是可取的，它們是高效、便捷地標記PreGC增殖的方法，而且本實驗結(jié)果也證實了NGF促進顆粒細胞增殖是與時間呈時效關(guān)系的。

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