馬振華，張連杰，馬艷琴*

(1.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801;2.山西農業(yè)大學 山西省環(huán)境獸醫(yī)學重點實驗室，山西 太谷 030801)

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人臍靜脈內皮細胞分離培養(yǎng)方法的建立及優(yōu)化

馬振華1，張連杰2，馬艷琴1*

(1.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801;2.山西農業(yè)大學 山西省環(huán)境獸醫(yī)學重點實驗室，山西 太谷 030801)

為優(yōu)化人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)原代及傳代的培養(yǎng)方法，建立一種簡便且能夠獲得數(shù)量較多及活力良好的HUVEC培養(yǎng)體系。分離臍靜脈并插管，用0.1%的II型膠原酶灌注消化分離內皮細胞。M199完全培養(yǎng)基懸浮并接種于細胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)。待細胞鋪滿80%時，0.25%胰酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察內皮細胞生長情況，姬姆薩染色法鑒定內皮細胞的形態(tài)，vWF因子相關抗原免疫熒光法鑒定內皮細胞。比較不同膠原酶消化時間、不同接種密度、不同胰酶消化時間、不同培養(yǎng)基組分對細胞得率、形態(tài)和純度的影響。結果表明，原代培養(yǎng)時，II型膠原酶最佳消化時間為15 min，最佳接種密度為1×106mL-1；傳代培養(yǎng)時，胰酶最佳消化時間為2 min。倒置顯微鏡下觀察和姬姆薩染色結果顯示，貼壁內皮細胞呈長梭形,且呈單層鋪路石狀排列。免疫熒光檢測結果表明，細胞胞漿呈綠色熒光，為vWF因子陽性細胞，DAPI襯染細胞核呈藍色，顯示內皮細胞純度接近100%。本實驗成功建立了HUVEC原代分離培養(yǎng)的優(yōu)化體系，純度高、活力好，為后續(xù)研究做好了準備。

人臍靜脈血管內皮細胞；膠原酶消化法；姬姆薩染色；免疫熒光技術

血管內皮細胞(endothelial cells,EC)是一種多功能細胞，其在多種疾病中所起的重要作用已越來越受到重視，已成為當今醫(yī)學、生物學領域的重要研究對象[1]。人臍靜脈 (human umbilical vein，HUV)是培養(yǎng)血管內皮細胞的常用來源之一，與動物血管內皮細胞相比，人臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)使實驗條件更符合人體情況，結果更有意義[2]。自1963年起，人們便不斷地開展內皮細胞體外培養(yǎng)的研究，以便提供一個接近人體的研究模型。但由于人血管內皮細胞培養(yǎng)條件要求高，不易在體外生長，長期以來只能在體外維持培養(yǎng)2～3代。1981年[3]，Maciag的研究使人血管內皮細胞的體外培養(yǎng)獲得突破性進展，他用從牛下丘腦提取的ECGF作為生長促進劑，成功地使人血管內皮細胞在體外連續(xù)培養(yǎng)15～20代。目前，獲取內皮細胞的方法有機械刮取法、組織貼塊法和酶消化法3種[4,5]。前2種易混雜平滑肌細胞、成纖維細胞等其它血管壁細胞，近年已逐漸被酶消化法取代。

本研究采用II型膠原酶灌注法消化分離臍靜脈內皮細胞，觀察原代培養(yǎng)時不同的膠原酶消化時間、不同接種密度和傳代培養(yǎng)時不同的胰酶-EDTA消化時間對細胞得率和細胞活力狀態(tài)的影響，并對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，從而改進并建立一套操作性強、細胞獲得多、傳代次數(shù)多的HUVEC培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用新生兒臍帶取自晉中市第二人民醫(yī)院，產婦體健，剖宮產，實驗方案經醫(yī)院倫理委員會批準，產婦及家屬均簽署知情同意書。

主要試劑：M199培養(yǎng)基、II型膠原酶、0.25%胰酶-EDTA、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Gibco公司)，明膠(MP公司)，4%多聚甲醛、0.2%TritonX-100、10%山羊血清(Solarbio公司)，兔抗人VIII因子抗體、FITC標記山羊抗兔-IgG(博奧森公司)，HEPES、肝素、谷氨酰胺、內皮細胞生長因子(VEGF)(Sigma公司)。M199完全培養(yǎng)基添加：20%(或10%)胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、6.25 U·mL-1肝素、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、10 ng·mL-1VEGF。

主要儀器：巴氏吸管、細胞培養(yǎng)瓶、六孔培養(yǎng)板(Corning公司)，輸液器延長管。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC原代分離培養(yǎng)

將臍帶放置于大平皿中，擠去血液，用巴氏吸管吸棄，剪去血腫多的和有夾痕的臍帶段。臍帶的一端剪斷，暴露出兩條臍動脈和一條臍靜脈(臍動脈壁厚，管腔小，靜脈壁薄，管腔大)。剪輸液延長管適當長度，插入臍靜脈3 cm以上，止血鉗固定。從延長管的一端用20 mL注射器吸取PBS沖洗臍靜脈，吸棄洗液。將臍帶轉移至新的平皿，結扎另一端臍帶，注入10 mL左右膠原酶溶液，充盈臍靜脈，止血鉗封閉端口，37℃培養(yǎng)箱孵育。本實驗對孵育時間進行優(yōu)化，設置10、15、20 min3個時間梯度，觀察膠原酶不同處理時間對細胞得率、純度的影響。期間，輕揉臍帶，以助于細胞脫落。處理結束后打開下端，使酶液收集入離心管，PBS沖洗，并收集。1000 r·min-1離心5 min，棄上清，用含20%FBS的M199完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種于明膠預包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 原代細胞不同接種密度的比較

臺盼藍拒染法進行細胞計數(shù)，設置1×104、1×105、1×106和1×107mL-14個不同的接種濃度，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每2天換液一次，觀察細胞生長情況及原代培養(yǎng)時間。

1.2.3 HUVEC傳代時胰酶處理時間的比較

吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預熱的PBS洗2次(以去除殘留的血清)。加入預熱的胰酶-EDTA溶液，覆蓋細胞(25 cm2加0.5 mL)，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育。本實驗對孵育時間進行優(yōu)化，設置1、2、3 min 3個時間梯度，觀察不同胰酶消化時間對細胞脫壁效果及細胞活力的影響。

處理結束后加5～7 mL預熱的含血清M199培養(yǎng)基，以終止胰酶的作用。用巴氏吸管反復吹打，使細胞團塊分離，1000 r·min-1，離心5 min。傾倒上清，用含10%FBS的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基重懸細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.4 HUVEC的鑒定

培養(yǎng)的細胞在相差顯微鏡下進行形態(tài)學觀察，并在6孔培養(yǎng)板制備細胞爬片，姬姆薩染色法更清晰地呈現(xiàn)細胞形態(tài)圖像。采用vWF抗體免疫熒光法鑒定HUVEC細胞，具體操作如下：從培養(yǎng)板中取出細胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min；0.2%TritonX-100破膜；10%山羊血清室溫封閉30 min；加入兔抗人vWF抗體(1∶100稀釋)，放入濕盒內，37℃，60 min；加入FITC標記山羊抗兔-IgG，37℃避光孵育60 min；5 μg·mL-1的DAPI室溫襯染細胞核2 min，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 膠原酶不同消化時間對細胞純度的影響

研究發(fā)現(xiàn)孵育10 min時，內皮細胞并未完全脫落，細胞數(shù)量較少；孵育20 min時，不僅內皮細胞脫落，平滑肌細胞也部分脫落，給后期純化培養(yǎng)造成困難。最佳孵育時間是15 min，此時，內皮細胞消化完全，得率較高且無雜細胞的污染。HUVEC倒置顯微鏡下形態(tài)學觀察：細胞2 h開始貼壁，24 h大部分貼壁，到48 h已完全貼壁。如圖1所示，細胞呈長梭形生長,且呈單層鋪路石狀排列。姬姆薩染色后細胞形態(tài)學觀察如圖2所示，細胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿染成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細胞染色圖像。

vWF抗體免疫熒光法鑒定結果顯示：熒光顯微鏡下觀察到胞質中可見大量綠色熒光，為vWF抗原陽性細胞，即人臍靜脈內皮細胞。DAPI襯染所有的胞核均呈藍色熒光，以PBS緩沖液替代兔抗人vWF抗體的陰性對照無此反應。如圖3顯示，所有的細胞均為HUVEC，純度接近100%。

2.2 不同接種密度細胞生長狀態(tài)的比較

比較了4個接種密度下原代HUVEC細胞的生長狀態(tài)及原代培養(yǎng)時間，結果見表1。1×104mL-1組細胞分布稀疏，培養(yǎng)10 d以上未達到匯合，且后期細胞變大、形態(tài)不規(guī)則，不能傳代； 1×107mL-1組細胞密度太高，平均1.2 d即達到匯合需要傳代；1×106mL-1組平均4.1 d能達到80%匯合，可以傳代，認為1×106mL-1是適宜的接種密度。

圖1 倒置顯微鏡下觀察HUVEC呈典型的“鋪路石”形態(tài)(100×)Fig.1 The characteristic “cobblestone” morohology of HUVEC in culture under an inverted microscope(100×)

圖2 HUVEC的吉姆薩染色(100×)Fig.2 Giemsa staining of HUVEC(100×)

圖3 vWF抗體免疫熒光法鑒定HUVEC(100×)Fig.3 Identifying the HUVEC by immunostaining with antibodies against vWF factor(100×)

表1 原代培養(yǎng)不同接種密度下原代培養(yǎng)時間的比較Table 1 Comparing the primary culture time in different planting density

2.3 不同胰酶消化時間對傳代后細胞數(shù)量及活力的影響

當胰酶消化時間為1 min時，細胞并未全部從培養(yǎng)板底部脫落，傳代后的培養(yǎng)瓶中，細胞濃度太低；當消化時間為3 min時，胰酶對細胞的作用時間太長，使細胞活力降低，導致傳代后的培養(yǎng)瓶中細胞長勢不好，且貼壁性差。結果表明，最佳的消化時間是2 min，此時，培養(yǎng)板上的細胞幾乎完全脫落，而且傳代后的細胞能在2 h左右貼壁，長勢良好。所以，本實驗消化時間采用2 min，消化過程中，用顯微鏡檢測細胞分離的狀態(tài)，也可以輕輕敲打細胞瓶的側壁，以促進細胞分離。

3 結論與討論

3.1 HUVEC分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化

膠原酶灌注消化法分離HUVEC作用溫和，能夠獲得純度較高的內皮細胞，適用于人和多種動物較大血管內皮細胞的分離和培養(yǎng)，故是分離血管內皮細胞的常用方法[6]。本實驗使用輸液器的延長管將膠原酶注入靜脈后，頂端和末端均用止血鉗固定，避免了注射器直接接觸靜脈內皮，對內皮細胞造成損傷，從而使得酶消化的方法簡單高效[7]。原代培養(yǎng)時，對膠原酶消化時間進行了優(yōu)化，結果表明II型膠原酶的最佳消化時間是15 min。傳代培養(yǎng)時，胰酶-EDTA的最佳消化時間是2 min，而且這一時間也并非固定，取決于胰酶-EDTA的活力(如反復凍融會降低胰酶活力)?？傊?，當胰酶-EDTA消化細胞時，應在倒置顯微鏡下，密切關注細胞的動態(tài)，當細胞大范圍開始流動，即終止消化。

接種密度亦是影響細胞生長的關鍵因素。密度過高影響貼壁細胞的伸展和營養(yǎng)；密度過低，細胞無法形成生長需要的細胞社會，生長緩慢造成無法傳代或達到傳代密度所需的時間過長，造成原代細胞老化，失去了原有形態(tài)及特性[8]。且不同的細胞類型適宜的接種密度是不同的，故需要通過實驗摸索。經比較發(fā)現(xiàn)，1×106mL-1是HUVEC適宜的接種密度。HUVEC屬于難貼壁型的細胞，體外培養(yǎng)時細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板預先用2%明膠包被處理會極大改善細胞的貼壁性能，增加培養(yǎng)細胞的存活率。

3.2 HUVEC培養(yǎng)基的選擇

血清是動物細胞培養(yǎng)基的重要組成成分，血清質量的優(yōu)劣直接影響細胞培養(yǎng)的成功與否[9]。作者對20余次的培養(yǎng)條件進行摸索，比較了不同廠家、不同來源的血清對細胞生長狀態(tài)的影響，結果表明選擇高質量的胎牛血清是HUVEC培養(yǎng)成功的關鍵，并在原代培養(yǎng)中使用20%血清含量的M199培養(yǎng)基以利于細胞的貼壁，24 h后更換為10%血清含量的培養(yǎng)基即能滿足HUVEC生長的需要。內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是維持血管內皮細胞在體外長期培養(yǎng)的必要條件[10]。在實驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入了VEGF后，細胞的長勢和貼壁性都比沒添加VEGF時有明顯的改善。文獻顯示，HUVEC培養(yǎng)時肝素鈉的添加可使內皮細胞的純度提高[11]；谷氨酰胺在細胞生長過程中會消耗，亦需在培養(yǎng)基中補充添加。

本實驗建立的分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)的HUVEC原代細胞和傳代細胞經倒置顯微鏡觀察、姬姆薩染色形態(tài)觀察及免疫熒光染色技術鑒定，可以確定培養(yǎng)的細胞為內皮細胞且純度高、細胞貼壁性好，為進一步的基礎和臨床研究提供有用的細胞模型。

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(編輯：馬榮博)

Establishment and Optimizing of the Method of Isolating and Culturing Human Umbilical Vein Endothelial Cells in Vitro

Ma Zhenhua1,Zhang Lianjie2,Ma Yanqin1*

(1.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;2.ShanxiKeyLaboratoryofEnvironmentalVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Objective To build a simple and efficient culture system which can get more and active human umbilical veins endothelial cells.Methods The newborn umbilical cord was collected and placed in the HBSS collection medium.A cannula was inserted into the vein.Pre-warmed collagenase II was filled into it to isolate the endothelial cells.The cells were collected by centrifugation and resuspended in serum containing culture medium.Then they were transfered to a tissue culture flask and placed in an incubator at 37℃，5% CO2.When a confluent monolayer had formed，the HUVECs were subcultured by 0.25% trypin solution.The cells were observed using an inverted microscope and stained with Giemsa.Then the cells were identified by their positive immunostaining with antibodies against vWF factor.The optimal digestion time of collagenase and trypin was identified.The optimal planting density was analyzed.Result The optimal digestion time of collagenase was 15 min in primary culture and that of the trypin in subculture was 2 min.The optimal planting density was 1×106mL-1The confluent monolayers of HUVEC exhibited the characteristic "cobblestone" morohology in culture under an inverted microscope.Immunofluorescence showed that the cytoplasm presented green fluorescence which was vWF factor positive cell.The nucleus was dyed blue by DAPI.The purity of the cultured endothelial cells was almost 100%.Conclusion We established successfully the optimal system of primary HUVEC culture,which provided high-graded cell models for further research.

Human umbilical vein endothelial cells; Collagenase digestion; Giemsa staining; Immunofluorescence

2014-12-06

2015-01-10

馬振華(1989-)，女(漢)，山西大同人，在讀碩士，研究方向：心血管毒理學。

*通訊作者：馬艷琴，博士，副教授，碩士生導師。Tel:0354-6286908; E-mail:mayanqin466@163 com

國家自然科學基金(31302155，31302158);山西農業(yè)大學博士啟動基金(2013YJ39)

Q813.1

A

1671-8151(2015)03-0285-05