張振中 劉南波 劉煜凡 李基偉 付小兵 吳 旭

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸心血管外科， 廣東 廣州 510515； 2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048)

·論 著·

低氧處理對不同年齡C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

張振中1,2劉南波1,2劉煜凡1李基偉1,2付小兵2吳 旭1

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸心血管外科， 廣東 廣州 510515； 2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048)

目的：探討低氧處理對不同年齡C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖的影響。方法：全骨髓法從3～6周年輕C57小鼠(年輕組)股骨和脛骨的骨髓中提取、分離BMSCs，傳代至第6代，部分于37 ℃、5%CO2條件下中常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)5 d觀察細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)目，繪制細(xì)胞生長曲線；部分細(xì)胞進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)。另取第6代BMSCs，隨機(jī)分為低氧處理組(37℃、5%O2條件下培養(yǎng)30 min，再常規(guī)培養(yǎng))和陰性對照組(不行低氧處理，僅常規(guī)培養(yǎng))，常規(guī)培養(yǎng)8 h后固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。觀察兩組細(xì)胞處理前后的數(shù)量變化。全骨髓法提取 18～24個月老齡C57小鼠(老齡組)的骨髓細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)12 d觀察細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)目并繪制細(xì)胞生長曲線。將老齡組C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞分為低氧處理組和陰性對照組，處理方法同年輕小鼠低氧處理和陰性對照組，于常規(guī)培養(yǎng)24 h后固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，觀察兩組細(xì)胞處理前后的數(shù)量變化。結(jié)果：年輕C57小鼠BMSCs增殖能力強(qiáng)，可傳代至第6代，經(jīng)過5 d的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，并具有成骨、成脂誘導(dǎo)分化能力；但經(jīng)低氧處理后，BMSCs呈片狀脫落。老齡C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞增殖能力差，經(jīng)過12 d的原代培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，并且只有一個集落形成；經(jīng)低氧處理，貼壁細(xì)胞數(shù)量銳減，無新的集落形成。結(jié)論：低氧處理不能在體外擴(kuò)增階段提高C57小鼠BMSCs的增殖能力。

低氧處理 C57小鼠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞增殖

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有支持造血、自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)等諸多功能，在組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)和多種疾病的治療中有巨大潛力[1-2]。我們先前的研究已經(jīng)證實(shí)了小鼠BMSCs在促進(jìn)創(chuàng)面愈合中的作用[3-4]。然而，隨著供體年齡的增長，MSCs在體內(nèi)的數(shù)量減少，增殖能力變差，治療作用也隨之下降[5]。Fehrer等[6]報(bào)道，人體中骨小梁表面密質(zhì)網(wǎng)內(nèi)骨髓的集落形成能力是周圍其他骨髓的4倍。而骨小梁表面密質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的O2濃度為 1%～7%，明顯低于其他部位。故推測低氧環(huán)境更有利于人BMSCs的生長。有報(bào)道稱，適度的低氧處理可促進(jìn)人類、大鼠、兔等物種BMSCs的增殖[7-11]。

人的BMSCs不易獲取，而小鼠與人的同源性較高，是良好的參照對象。目前關(guān)于低氧處理對C57小鼠BMSCs影響方面的研究很少，并且尚未發(fā)現(xiàn)低氧處理對老化C57小鼠BMSCs影響方面的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們選取不同年齡段的C57小鼠作為研究對象，希望了解低氧對C57小鼠BMSCs增殖的影響及低氧能否改善老齡C57小鼠BMSCs的生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與實(shí)驗(yàn)材料 成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及油紅“O”、茜素紅均購于中國廣州賽業(yè)生物科技公司。4%多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司。胎牛血清、DMEM粉末、0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司。CY-12C型數(shù)字測氧儀購于建德市新安江分析儀器二廠。3～6周(年輕組)和18～24個月(老齡組)C57BL/6小鼠各20只，雌雄不限，均購于北京軍事科學(xué)院動物中心。根據(jù)The Jackson Laboratory公開的數(shù)據(jù)，C57小鼠出生后3～6周相當(dāng)于人類的20～30歲，出生后18～24個月相當(dāng)于人類的56～69歲。

1.2 低氧裝置的制作 本研究中所用低氧裝置參考Billups-rothenberg公司的MIC101型細(xì)胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，并作了相應(yīng)改進(jìn)(圖 1)。低氧裝置由A、B兩部分構(gòu)成，中間由兩個軟管連接。含5%CO2的混合氣體從常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)引入，進(jìn)入玻璃鐘罩內(nèi)與活性鐵發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，消耗O2并生成氧化鐵。根據(jù)阿伏伽德羅定律可出換算出低氧裝置中各氣體組分的變化(表1)，可見，隨著氧體積分?jǐn)?shù)的下降，N2的體積分?jǐn)?shù)升高最為顯著，而CO2幾乎不變。使用時(shí)，先將需要作低氧處理的細(xì)胞放在B罐中，密閉B罐，用兩個軟管將A、B兩部分連接，開啟閥門，反復(fù)擠壓換氣氣囊，形成持續(xù)的循環(huán)氣流，化學(xué)反應(yīng)所消耗的氣體可從進(jìn)氣口持續(xù)補(bǔ)充。隨著A、B之間的氣體交換，B罐內(nèi)的O2濃度逐漸降低，并實(shí)時(shí)顯示在數(shù)字測氧儀的液晶顯示屏上。當(dāng)B罐內(nèi)的氧濃度達(dá)到設(shè)定值時(shí)停止擠壓氣囊，關(guān)閉閥門，斷開連接。B罐可酒精消毒后整體放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 低氧裝置示意圖

氣體組分空氣中常規(guī)培養(yǎng)箱中5%O20%O2O221.0019.965.000CO20.035.005.936.25N278.0074.1287.9792.60惰性氣體0.940.891.061.11其他0.030.030.030.04

1.3 年輕組C57小鼠BMSCs的獲取、鑒定和低氧處理

1.3.1 BMSCs的獲取與傳代 采用全骨髓法提取年輕組C57小鼠的BMSCs。3～6周C57小鼠斷髓處死，取其股骨和脛骨，剪除骨骺，用5 ml注射器吸取PBS反復(fù)沖洗骨干，沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，沉淀的細(xì)胞接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每只小鼠的細(xì)胞接種在1個培養(yǎng)皿中。每皿細(xì)胞加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)。24 h后半量換液1次，此后每48 h全量換液1次。待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，徹底移除DMEM完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1～2次，0.25%的胰蛋白酶消化1～3 min，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞輕輕吹起，制成單細(xì)胞懸液， 1 000 r/min 離心5 min，沉淀的細(xì)胞按照1×104/mm2的密度接種于新的培養(yǎng)皿中。如此傳代至第6代，細(xì)胞用上述方法消化，消化下來的細(xì)胞混懸于細(xì)胞凍存液中，細(xì)胞凍存管分裝，梯度凍存(4 ℃ 30 min， -20 ℃ 1～2 h， -80 ℃ 過夜，液氮中保存)。

1.3.2 第6代BMSCs的鑒定 凍存細(xì)胞以37 ℃水浴迅速復(fù)溫后移入離心管中，加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min,沉淀的細(xì)胞按照1×104/mm2的密度接種于培養(yǎng)皿中，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，并繪制連續(xù)5 d的細(xì)胞生長曲線。用相同方法培養(yǎng)第6代BMSCs，待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)：移除DMEM完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1～2次，換用成骨誘導(dǎo)專用培養(yǎng)基或成脂誘導(dǎo)專用培養(yǎng)液A，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞每48 h全量換液1次，成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞48 h后換用成脂誘導(dǎo)專用培養(yǎng)液B,24 h后再換回成脂誘導(dǎo)專用培養(yǎng)液A，如此反復(fù)進(jìn)行；第9天，移除成骨或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1～2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞約15 min，移除甲醛溶液，成骨誘導(dǎo)細(xì)胞加入1 ml茜素紅染色液染色約3 min，成脂誘導(dǎo)細(xì)胞加入1 ml油紅“O”染色液染色約30 min。

1.3.3 BMSCs的低氧處理 取凍存的第6代年輕C57小鼠的BMSCs復(fù)蘇，并隨機(jī)分為低氧處理組和陰性對照組，按照1×104/mm2的密度接種于6個培養(yǎng)皿中。細(xì)胞復(fù)蘇后24 h，將低氧處理組移至自制低氧培養(yǎng)裝置的B罐中，擠壓換氣氣囊，直至數(shù)字測氧儀的讀數(shù)下降至5%，將細(xì)胞連同B罐一起放入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%O2作用30 min后將細(xì)胞移出B罐，在常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對照組不作低氧處理，其他過程同低氧處理組。低氧處理后8 h，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞的生長情況。

1.4 老齡組C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的原代培養(yǎng)和低氧處理

1.4.1 骨髓貼壁細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取18～24個月老齡組C57小鼠，骨髓細(xì)胞獲取和骨髓貼壁細(xì)胞原代培養(yǎng)方法同年輕組。連續(xù)12 d顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.2 骨髓貼壁細(xì)胞的低氧處理 將培養(yǎng)的老齡C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞接種于6個培養(yǎng)皿中，每只小鼠的細(xì)胞接種在1個培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為低氧處理組和陰性對照組。細(xì)胞接種后72 h，對低氧處理組的骨髓貼壁細(xì)胞進(jìn)行低氧處理，方法同年輕小鼠細(xì)胞的低氧處理組。陰性對照組不作低氧處理，其他過程同低氧處理組。低氧處理后將細(xì)胞放回常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞的生長情況。

2 結(jié) 果

2.1 年輕C57小鼠BMSCs的培養(yǎng)和鑒定 年輕C57小鼠第6代BMSCs經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)后，茜素紅染色和油紅“O”染色均呈陽性(圖2，見封二)，提示細(xì)胞具有分化潛能。年輕C57小鼠第6代BMSCs在接種后的5 d里，細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞密度呈上升趨勢，任意 2 d之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)第5天，培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞數(shù)量較第1天提高了3倍(圖3)。

注：與任意時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05

圖5 年輕C57小鼠BMSCs低氧處理后非脫落區(qū)域細(xì)胞數(shù)與低氧處理前及陰性對照組的比較

2.2 低氧處理對年輕C57小鼠BMSCs增殖的影響 年輕C57小鼠BMSCs低氧處理后8 h，培養(yǎng)皿底部有數(shù)十塊大小不一的盤狀細(xì)胞脫落區(qū)域，脫落呈斑片狀,而陰性對照組則無此現(xiàn)象(圖4，見封二)。低氧處理后非脫落區(qū)域細(xì)胞數(shù)和低氧處理前及陰性對照組處理前、后相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。2.3 老齡組C57小鼠BMSCs的原代培養(yǎng) 老齡C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞原代培養(yǎng)12 d，只有一個集落形成(圖6，見封二)。在原代培養(yǎng)的12 d里，細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞數(shù)總體呈下降趨勢，第8、9、10、11、12天與其他任意一天比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。12 d后培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞數(shù)量降低了3倍。因細(xì)胞增殖能力差，無法進(jìn)行傳代。

注；與任意時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05

2.4 低氧處理對老齡C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的影響 老齡組C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞低氧處理后24 h，貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(圖8A，見封二),而陰性對照組無此現(xiàn)象(圖8B，見封二)。低氧處理后貼壁細(xì)胞的數(shù)量和低氧處理前及陰性對照組處理前后相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)。

注：與低氧處理組低氧處理后比較：*P<0.05

3 討 論

實(shí)驗(yàn)研究顯示，自體BMSCs在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等疾病的治療中均取得了明顯療效[12-16]。自體間充質(zhì)干細(xì)胞移植因不受倫理學(xué)限制、無免疫排斥、取材方便、對供體和受體無害而備受關(guān)注。然而，自體BMSCs移植也存在一些問題，如：體外擴(kuò)增階段個體差異大，體外培養(yǎng)滯后于病情需要，潛在的癌變風(fēng)險(xiǎn)等。其中體外擴(kuò)增階段的個體差異是制約臨床應(yīng)用的一個重要方面。

低氧研究中發(fā)現(xiàn)，1.5%O2的低氧狀態(tài)可促進(jìn)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的人BMSCs增殖，但是在無血清條件下則表現(xiàn)為抑制增殖[7]；3%O2的間歇性低氧對人BMSCs無明顯影響，3%O2的持續(xù)性低氧則可促進(jìn)其增殖[8]；1%O2的持續(xù)性低氧可促進(jìn)人BMSCs增殖，促進(jìn)集落形成，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的分泌，抑制人BMSCs的成骨分化[9]。1%O2是非致死性條件，但可短暫抑制大鼠BMSCs的增殖[10]；4%O2可促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖，促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)，抑制BMSCs的成骨分化[11]；1%O2條件下BMSCs黏附能力隨低氧時(shí)間的延長而增強(qiáng)[11]。低氧也可以促進(jìn)兔BMSCs的增殖[17]?？梢姡m度的低氧處理可促進(jìn)人類、大鼠、兔等動物BMSCs的增殖。

作為較常用的實(shí)驗(yàn)動物，C57小鼠BMSCs對缺氧的反應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究中細(xì)胞生長曲線和成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，利用全骨髓法提取出的年輕C57小鼠BMSCs具有較強(qiáng)的自我更新能力和多向分化能力。

參照文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)，我們選用5%O2作為低氧處理?xiàng)l件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年輕C57小鼠BMSCs經(jīng)低氧處理后8 h，培養(yǎng)皿底部有數(shù)十塊大小不一的盤狀細(xì)胞脫落區(qū)域，且非脫落區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量與低氧處理前及陰性對照組處理前后比較未發(fā)生明顯變化。表明低氧處理對年輕C57小鼠BMSCs造成的這種“致脫落”作用沒有均一性。這種現(xiàn)象尚未見報(bào)道，具體機(jī)制尚不清楚。我們推測，低氧處理致培養(yǎng)細(xì)胞脫落的現(xiàn)象最初從散在的某些細(xì)胞開始，并通過某種未知的方式傳遞給周邊的其他細(xì)胞，如漣漪一般向周圍擴(kuò)散，最終形成了斑片狀脫落區(qū)域。

老齡C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞在連續(xù)原代培養(yǎng)12 d后，培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞數(shù)量減少了3倍，并且在3個培養(yǎng)皿中只觀察到一個集落形成，顯示細(xì)胞增殖能力差，集落形成能力差?？梢?，18～24個月的老齡C57小鼠適于BMSCs生理性老化的研究。全骨髓法是利用了BMSCs貼壁生長的特性，可以和其他細(xì)胞作初步分離，再利用BMSCs優(yōu)勢生長的特性，經(jīng)過多次換液和傳代，可獲得純化的BMSCs。因此，骨髓貼壁細(xì)胞可視為粗提純的BMSCs。由于老齡組C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的增殖能力差，現(xiàn)有技術(shù)條件下無法通過傳代獲得純化的BMSCs。因此，我們直接對老齡組C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞進(jìn)行低氧處理，結(jié)果培養(yǎng)皿底部貼壁細(xì)胞銳減。

綜上所述，低氧處理既損害年輕C57小鼠BMSCs的正常生長，也損害老齡C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的原代培養(yǎng)。提示低氧處理對不同物種BMSCs增殖的影響存在差異性，其機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。

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Effects of hypoxia on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells isolated from C57 mice of different age

Zhang Zhenzhong*, Liu Nanbo, Liu Yufan, Li Jiwei, Fu Xiaobing, Wu Xu.*

Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, 510515, Guangdong, China

Wu Xu(E-mail:wuxu_southhospital@163.com) Fu Xiaobing(E-mail:fuxiaobing@vip.sina.com)

Objective:To investigate the effects of hypoxia on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) isolated from C57 mice of different age. Methods: BMSCs were isolated from the marrow of femurs and tibias of young C57 mice aged 3 to 6 weeks (young group) by whole bone marrow adherence method, and they were cultured. The 6th generation of BMSCs were routinely cultured under the condition of 5% CO2and 37 ℃, their potential of differentiation to osteocytes and adipocytes were observed, and the cell numbers were counted,and a growth curve of 5 consecutive days was drawn. Another portion of the 6th generation of BMSCs was randomly divided into hypoxia group and non-hypoxia group. The cells of hypoxia group were cultured under the condition of 5% O2and 37 ℃ for 30 minutes, followed by routine culture for 8 hours, while the non-hypoxia group was routinely cultured continously. The change in the cell number of the two groups was observed with crystal violet staining. Adherent cells were isolated from old C57 mice aged 18 to 24 months (aging group) with whole bone marrow adherence method. The cells were routinely cultured, the number of cells were observed and a growth curve of 12 consecutive days was drawn. The bone marrow adherent cells of old C57 mice were divided into two groups, and they were treated in same way as the young hypoxia group. After a routine culture of 24 hours, the change in the cell number was observed with crystal violet staining. Results:The proliferation ability of BMSCsof young C57 mice was robust, and they could be sustainable up to the 6th generation. The number of cells gradually grew in 5 days, and they showed the potential of osteogenic or adipogenic differentiation. However, the cells fell off in flakes under hypoxia treatment. The proliferation ability of bone marrow adherent cells of aging C57 mice was poor. After a primary culture of 12 days, the cell number was gradually decreased, and only one colony was found to be formed. The number of adherent cells decreased obviously under the hypoxic treatment, and no new colony was formed. Conclusions:Hypoxia treatment is not able to improve the proliferation ability of BMSCs of C57 miceinvitroamplification stage.

Hypoxia C57 mouse Bone marrow mesenchymal stem cell Cell proliferation

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.007

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2012CB518105)

吳旭，主任醫(yī)師(E-mail:wuxu_southhospital@163.com) 付小兵，研究員，中國工程院院士(E-mail:fuxiaobing@vip.sina.com)

2015-01-14)