劉樹玲 丁 麗 邢 昆

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 日照 276826)

兔組織籠無菌感染模型的制備*

劉樹玲 丁 麗 邢 昆

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 日照 276826)

目的 制備兔組織籠無菌感染模型，為藥物藥動學(xué)-藥效學(xué)結(jié)合模型(pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling,PK-PD)研究提供在體動物實驗載體。方法 選取健康家兔28只，耳緣靜脈注射鹽酸賽拉嗪注射液0.15ml/kg麻醉，每只分別背部備皮、切開皮膚，然后在皮下植入長約5cm的無菌中空胸腔引流管1個，繼而在無菌操作下手術(shù)縫合。術(shù)后應(yīng)用青霉素肌肉注射3d以預(yù)防感染。結(jié)果 5只家兔先后因不同原因死亡，23只家兔均獲得清亮的無菌組織液，成功建立兔組織模型，成功率為82.14%。結(jié)論 通過嚴(yán)格控制無菌操作，選擇合適的麻醉劑，手術(shù)刀口選擇在兔背部，術(shù)后及時預(yù)防感染，可以成功制備兔組織籠無菌感染模型，并獲得清亮的無菌組織液。

兔組織籠模型；PK-PD；無菌操作；組織液

藥動學(xué)-藥效學(xué)結(jié)合模型(pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling,PK-PD)是研究藥物在體內(nèi)變化過程與其藥效消長關(guān)系的一種工具，其借助數(shù)學(xué)方法定量表達(dá)濃度、時間和效應(yīng)之間的關(guān)系，對藥物的研發(fā)和合理使用具有指導(dǎo)意義[1]。兔組織籠感染模型是近年來剛發(fā)展起來的一項用于抗菌藥物PK-PD研究的新技術(shù)[2]。兔組織籠感染模型建立成功后,可以通過注射器經(jīng)管上的小孔反復(fù)、較大量地抽取組織液。運(yùn)用該模型可以通過1只動物而完成整個研究過程,與傳統(tǒng)感染模型相比[3-4]，不僅避免了分批處死動物所帶來的誤差,而且還可以用于分析組織液內(nèi)的藥物濃度與組織液內(nèi)病原菌之間的關(guān)系,非常適合用于抗菌藥物療效的觀察。因此,該模型是一個較好的研究抗菌藥物的PK-PD動物模型。為探究該模型制備的可行性，我們進(jìn)行了兔組織籠模型的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通家兔，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，普通飲食。

1.2 藥品與器械

1.2.1 藥品 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；尼可剎米注射液(吉林省華牧動物保健品有限公司)；鹽酸賽拉嗪注射液(吉林省華牧動物保健品有限公司)；鹽酸利多卡因(山東圣魯制藥有限公司)；注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；碘伏(山東利爾康消毒科技有限公司)；地克朱利溶液(江西博萊大藥廠)。

1.2.2 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.3 模型制備

1.3.1 預(yù)實驗 實驗開始前先將實驗中所有用到的手術(shù)器械預(yù)先高壓消毒(121.3℃， 25min)并干燥后備用(下同)，隨機(jī)選取健康家兔1只，稱重、背部備皮后固定于兔臺上，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后3h后仍未見蘇醒，證明采用戊巴比妥鈉麻醉劑效果不理想。

又隨機(jī)選取健康家兔1只，手術(shù)操作同上，耳緣靜脈注射鹽酸賽拉嗪注射液0.05ml/kg麻醉(即參照說明書給予肌肉注射劑量的1/3)，家兔間歇性抽搐20min左右，達(dá)到麻醉效果，但麻醉時間較長。

另隨機(jī)選取健康家兔1只，手術(shù)操作同上，采用肌肉注射鹽酸賽拉嗪注射液0.15ml/kg麻醉，5min后突然間歇性抽搐持續(xù)20min，家兔麻醉后手術(shù)，術(shù)后肌肉注射尼克剎米注射液，15min后家兔蘇醒。因此，肌肉注射麻醉劑鹽酸賽拉嗪注射液后效果比戊巴比妥鈉好，但需要較長的誘導(dǎo)時間。由以上預(yù)實驗可知麻醉劑鹽酸賽拉嗪注射液給藥方式與劑量不易控制，其麻醉效果不理想，需考慮選擇其他麻醉劑。

1.3.2 兔組織籠無菌感染模型的制備 選取健康家兔28只，稱重、背部備皮后固定于兔收術(shù)臺上，耳緣靜脈注射鹽酸賽拉嗪注射液0.15ml/kg麻醉，家兔立即出現(xiàn)四肢肌肉松軟，瞳孔擴(kuò)大，角膜反射消失，昏迷逐漸加深，呼吸減慢變淺，備皮處碘伏消毒后鋪無菌洞巾，背部分次兩邊皮下注射利多卡因，每次1ml局部麻醉，用手術(shù)刀切開皮膚，鈍性分離皮下組織，在皮下植入5cm左右的無菌中空胸腔引流管[5]，然后用手術(shù)線縫合傷口，碘伏消毒傷口。耳緣靜脈注射尼克剎米注射液，2min后家兔蘇醒，手術(shù)完成后，給家兔帶防咬項圈以防止家兔回頭破壞手術(shù)傷口縫合部位。

術(shù)后連續(xù)肌肉注射3d青霉素預(yù)防家兔感染，并及時觀察家兔傷口愈合情況和日?；顒訝顩r。2周后家兔手術(shù)傷口愈合，4周后中空管內(nèi)充滿組織液，用無菌注射器抽取無菌胸腔引流管內(nèi)組織液0.1ml，用接種環(huán)接種于預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平皿內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h后經(jīng)檢驗無菌，證明實驗家兔組織籠模型建立成功。

2 結(jié)果

手術(shù)器械預(yù)先通過高壓消毒以嚴(yán)格控制無菌操作，選擇耳緣靜脈注射鹽酸賽拉嗪注射液0.15ml/kg麻醉家兔，手術(shù)刀口選擇在家兔背部，術(shù)后3d連續(xù)肌肉注射青霉素預(yù)防感染，5只先后因不同原因死亡，23只家兔均獲得清亮的無菌組織液，成功建立兔組織模型，成功率為82.14%。

3 討論

3.1 家兔死亡原因分析

實驗過程中家兔死亡，其一為麻醉劑致死，通過實驗分析發(fā)現(xiàn)，肌肉注射所用麻醉誘導(dǎo)時間較長，不適合制備大量兔組織籠模型實驗的應(yīng)用。嘗試縮短鹽酸賽拉嗪的麻醉時間，選擇耳緣靜脈注射(劑量為肌肉注射的1/3)，但因個體差異影響，劑量不易控制，因此，選用在寵物醫(yī)院中成熟應(yīng)用的鹽酸賽拉嗪注射液，結(jié)果其麻醉效果比戊巴比妥鈉和鹽酸賽拉嗪好。手術(shù)結(jié)束后1h，麻醉劑藥效會隨時間延長而逐漸失效，家兔由于手術(shù)傷口產(chǎn)生痛覺，往往會用牙齒咬開術(shù)后縫合的傷口(故給家兔帶防咬項圈以防止其回頭破壞手術(shù)傷口縫合部位)，盡管已預(yù)防用藥青霉素，但因傷口再次開裂致其感染死亡。1只家兔在手術(shù)后第2天死亡，解剖發(fā)現(xiàn)體內(nèi)無異常，懷疑是個體差異所致。術(shù)后發(fā)現(xiàn)家兔死亡前1d精神萎靡，身體癱軟，拒絕進(jìn)食，糞便不成形且伴下體糞便污染，懷疑家兔感染球蟲病。用地克朱利溶液預(yù)防，用藥后家兔未再發(fā)生死亡情況。

3.2 兔組織籠無菌感染模型制備的注意事項

首先建立無菌概念，在臨床醫(yī)療護(hù)理操作中，采用防止微生物進(jìn)入人體組織或其他無菌范圍的操作技術(shù)稱之為無菌操作[6]。實驗中所用手術(shù)器械都要經(jīng)過高溫高壓消毒滅菌方可使用，以降低動物感染幾率。

其次，宜選擇合適的麻醉劑，并按照家兔體重和用藥方式量取麻醉劑量。戊巴比妥鈉對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛抑制作用，隨用藥劑量的增加而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥效應(yīng)，大劑量時則產(chǎn)生麻醉作用，作用機(jī)制主要與阻斷腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)有關(guān)，其麻醉程度較深，不適合兔組織籠模型制備的使用。鹽酸賽拉嗪是一種腎上腺素受體激動劑，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的受體結(jié)合并激動受體，從而抑制突觸前膜去甲腎上腺素的釋放，具有強(qiáng)效鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及中樞性肌松作用，因靜脈注射起效時間快，適合大規(guī)模模型制備使用。尼可剎米對延髓呼吸中樞具有選擇性直接興奮作用，也可作用于頸動脈竇和動脈體化學(xué)感受器，反射性興奮呼吸中樞，提高對缺氧的敏感性，使呼吸加深加快，對大腦皮層，血管運(yùn)動中樞和脊髓亦有相應(yīng)的興奮作用。與鹽酸賽拉嗪配合使用，以縮短動物麻醉時間，加快蘇醒。

另外，手術(shù)刀口應(yīng)選擇在家兔前背部以防止家兔撕咬傷口，縫合傷口時宜先將皮下筋膜縫合，再縫合皮膚，以縮短傷口愈合時間。將5cm無菌胸腔引流管植入皮下的過程最為關(guān)鍵。在無菌胸腔引流管植入過程中，家兔皮下組織必須要充分分離，以減少切口張力，還需要注意無菌操作，防止切口及無菌胸腔引流管內(nèi)組織液的感染[7]。

通過嚴(yán)格控制無菌操作，選擇合適的麻醉劑，手術(shù)刀口選擇在兔背部，術(shù)后及時預(yù)防感染，可以成功建立兔組織模型，并獲得清亮的無菌組織液。為進(jìn)一步的PK-PD研究提供實驗動物載體。

[1] 丁莉.現(xiàn)代藥理學(xué)研究的新課題-PK-PD結(jié)合模型[J].湖北中醫(yī)雜志,2006,28(7):51-52.

[2] 崔俊昌,劉又寧,王睿等.左氧氟沙星對兔組織籠金黃色葡萄球菌感染的療效研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,12(3):291-294.

[3] Stein GE.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of newer fluoroquinolones[J].Clin Infect Dis,1996,23(Supple 1):S19-S24.

[4] Aminimanizani A,Beringer P,Jelliffe R.Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of the newer fluoroquinolone antibacterials[J].Clin Pharmacokinet,2001,40:169-187.

[5] 盛美艷，張蕓，劉明濤，等．環(huán)丙沙星在兔血液與組織液中的藥動學(xué)[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010,41(7):525-527.

[6] 李小寒，尚少梅.基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版杜，2006,127.

[7] 崔俊昌，劉又寧，王睿杭，等.左氧氟沙星對兔組織籠金黃色葡萄球菌感染的療效研究[J].中國臨床藥理治療學(xué)，2007,12(3):291-294.

The preparation of aseptic rabbit tissue cage infection model

LIUShuling,DINGLi,XINGKun

(School of Pharmaceutical Sciences, Jining Medical University, Rizhao 276826, China)

ObjectiveTo prepare a rabbit tissue cage model so as to provide drug animal carrier in vivo for drug PK-PD modeling study.Methods28 healthy rabbits were selected and injected with the anesthesia xylazine iv respectively.The back hair was cut in each rabbit, and then the skin was cut open. A 5cm of sterile hollow chest tube drainage was implanted subcutaneously. In the end the wound was sewed up with aseptic technique. After operation penicillin im was injected for 3 days to prevent infection.ResultsAmong the 28 rabbits, 5 rabbits were dead due to different causes. Clear and sterile tissue fluid were gotten from other 23 rabbits. A rabbit tissue model was established successfully, and the success rate was 82.14%.ConclusionBy stricted controlling aseptic operation, selecting the appropriate anesthesia and surgical incision in the back of the rabbit, timely postoperative anti-infection, a rabbit tissue cage model can be successfully established, so does clear tissue fluid.

A rabbit tissue cage model; PK-PD modeling; Aseptic technique; Tissue fluid

* [基金項目]2010年山東省自然科學(xué)基金項目(編號：ZR2010BL031)；2013年濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基金項目(編號：JY2013KJ011)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.005

R965.1

A

1000-9760(2015)02-023-03

2014-12-26)