曾 莉 綜述，刁奇志 審校(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗(yàn)科 402160)

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石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用*

曾 莉 綜述，刁奇志 審校(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗(yàn)科 402160)

石墨烯； 電化學(xué)免疫傳感器； 腫瘤標(biāo)志物

腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。其在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后、評(píng)價(jià)療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實(shí)用價(jià)值。目前檢測(cè)方法主要有放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法、蛋白芯片檢測(cè)法，這些方法存在靈敏度低、特異度低、放射性損害、反應(yīng)條件嚴(yán)格、操作繁瑣、分析困難等不足，限制其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。發(fā)展高靈敏的免疫分析技術(shù)對(duì)于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)有至關(guān)重要的意義。電化學(xué)免疫傳感器利用抗原和抗體間的高度特異性結(jié)合，將免疫分析法和電化學(xué)傳感器相結(jié)合，具有靈敏度高，分析速度快，操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉及選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。其中石墨烯由于其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的電化學(xué)性能、制備方法多樣化、成本低廉、適合于規(guī)?；苽?、可用于固定抗體等優(yōu)點(diǎn)，為電化學(xué)免疫傳感器性能的提高提供了一種全新方法。本文簡(jiǎn)單介紹了石墨烯的特點(diǎn)、制備方法，重點(diǎn)綜述了近年來石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的研究及應(yīng)用，并對(duì)目前存在的問題及發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 石墨烯特點(diǎn)及制備

1.1 石墨烯 自2004年Man大學(xué)的Geim等首次用機(jī)械剝離法獲得了單層石墨烯后，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和電化學(xué)性能就一直備受矚目。石墨烯是由碳原子以sp2雜化緊密連接包裹的六角晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)成的單原子層,是現(xiàn)今已知的最薄的二維材料[1-2]。石墨烯大的比表面積(理論表面積2 630 m2/g)和極強(qiáng)的電導(dǎo)能力(64 ms/cm)可以保證對(duì)待測(cè)物的高效吸附及負(fù)載，提高基于石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度及信噪比。此外，石墨烯還具有大的電位窗口、低電荷傳遞電阻、快速電子傳遞速率等獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)，可作為電極的理想材料并廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器新領(lǐng)域[3-4]。

1.2 石墨烯的制備 石墨烯類材料包括石墨烯、氧化石墨烯和還原氧化石墨烯等?，F(xiàn)今制備石墨烯的方法層出不窮：氧化石墨還原法、外延生長(zhǎng)法、電化學(xué)方法、電弧法、有機(jī)合成法、金屬表面生長(zhǎng)法、氧化減薄石墨片法、肼還原石墨烯法、乙氧鈉裂解法和切割碳納米管法等[5]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較多的通常為功能化的石墨烯、氧化石墨烯。因?yàn)槠浔砻鎺в辛u基、羧基等功能化基團(tuán)，可改善石墨烯的分散性、水溶性及穩(wěn)定性等，并可以通過?；磻?yīng)、酯化反應(yīng)等將其他基團(tuán)或生物分子修飾到氧化石墨烯表面[6]。目前主要利用Hummers法制得氧化石墨后，將氧化石墨經(jīng)高溫或者超聲處理,在其層間產(chǎn)生巨大能量而剝落形成氧化石墨稀片。由于超聲作用剝離程度高，而且處理過程無化學(xué)變化，能基本維持氧化石墨稀表面結(jié)構(gòu)，成為氧化石墨剝離的主要方法。

2 石墨烯修飾的免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用

腫瘤標(biāo)志物主要用于惡性腫瘤輔助診斷、病情和預(yù)后判斷、療效監(jiān)測(cè)和靶向定位治療。電化學(xué)免疫傳感器與傳統(tǒng)免疫測(cè)試相比，集免疫反應(yīng)、信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)檢測(cè)一體化，具有結(jié)構(gòu)緊湊、使用方便、靈敏度高、成本低、能微型化等特點(diǎn)，有利于對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，尤其在臨床腫瘤標(biāo)志物診斷領(lǐng)域，其作用越來越受到重視，成為目前較活躍的研究領(lǐng)域[7-8]。

石墨烯納米材料的應(yīng)用進(jìn)一步提高了免疫傳感器的靈敏度。Wu等[9]將摻雜氮的石墨烯修飾到玻碳電極上固定鱗狀上皮細(xì)胞抗原一抗，通過夾心免疫法實(shí)現(xiàn)對(duì)鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的檢測(cè)。由于石墨烯是一種零帶隙材料，原子摻雜可以調(diào)控其能帶結(jié)構(gòu)，提高電催化性能，由該方法修飾的傳感器檢出限低至15.30 ng/mL，線性范圍0.05～18.00 ng/mL。

2.1 檢測(cè)癌胚抗原(CEA) CEA可作為結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)記物及惡性腫瘤的輔助診斷。Li等[10]團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種檢測(cè)CEA的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。石墨烯與Nafion溶液超聲混勻后滴涂至玻碳電極，浸入含2.5 mmol/L的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀磷酸鹽緩沖液中，通過電化學(xué)阻抗法初步探索免疫傳感器的性能，其具有高靈敏度(0.17 ng/mL)，特異性好，干擾物質(zhì)如乙肝核心抗原、葡萄糖氧化酶、抗壞血酸等對(duì)電化學(xué)檢測(cè)過程無影響，可視為用于臨床診斷十分有前途的替代工具。

氧化石墨烯含有大量含氧官能團(tuán)，功能化后可與納米粒子、聚合物、有機(jī)金屬化合物等多種功能材料聯(lián)合修飾制備電極。例如Zhong等[11]課題組制備了納米金包裹的石墨烯復(fù)合納米材料修飾到電極上，與辣根過氧化物酶-anti-CEA交聯(lián)后，研制出的免疫傳感器檢測(cè)CEA的線性范圍為0.05～350.00 ng/mL，與傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶-抗CEA和納米金標(biāo)記的辣根過氧化物酶-抗CEA相比，其靈敏度提高了100倍，檢測(cè)限可達(dá)到 0.01 ng/mL。結(jié)果充分表明，功能化的石墨烯大的表面積和良好的電子傳輸效率在提高抗體固定量的同時(shí)也增強(qiáng)了酶活性中心電子的傳輸速率，從而增強(qiáng)了電極響應(yīng)信號(hào)，提高了免疫傳感器靈敏度。與標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法共同檢測(cè)54例血清標(biāo)本，檢測(cè)相符率高，對(duì)于腫瘤的早期診斷，提高腫瘤治愈率和預(yù)后具有重要應(yīng)用價(jià)值。

2.2 檢測(cè)甲胎蛋白 由于還原氧化石墨烯具有：(1)含大量缺陷和化學(xué)官能團(tuán)，促進(jìn)電荷轉(zhuǎn)移，具有高電化學(xué)活性；(2)其表面豐富的化學(xué)基團(tuán)易于功能化，有助于提高傳感器性能；(3)化學(xué)性能和電子特性高度可調(diào)；(4)相比絕緣石墨烯，還原氧化石墨烯能高效傳輸電荷；(5)通過共價(jià)法或非共價(jià)法被官能化來增強(qiáng)傳感器的靈敏度、特異性、負(fù)載能力、生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，所以多數(shù)基于石墨烯的電化學(xué)免疫傳感器選用還原氧化石墨烯修飾電極[12]。Xiao等[13]將非共價(jià)改性法制得的還原氧化石墨烯與苝四甲酸在堿性條件下一鍋法同時(shí)合成后，成功制備了釕/苝四甲酸/石墨烯修飾的固態(tài)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。該方法獲得的還原氧化石墨烯既能保留石墨烯的結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)，又能有效提高石墨烯的化學(xué)性質(zhì)。表現(xiàn)出較吸附衍生物釕復(fù)合物約21倍以上的發(fā)光量子效率，對(duì)甲胎蛋白檢測(cè)的靈敏度高達(dá)0.20 pg/mL，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有廣大的應(yīng)用前景。氧化石墨烯也可以通過化學(xué)、電化學(xué)、熱還原等技術(shù)轉(zhuǎn)化成還原氧化石墨烯，提高其導(dǎo)電性與傳感性能。Qi等[14]在氧化石墨烯還原過程中注入一氧化碳?xì)怏w，利用一鍋法得到了還原氧化石墨烯，自主合成了以鈀還原氧化石墨烯修飾電極的免疫傳感器。試驗(yàn)結(jié)果表明，其能有效促進(jìn)電荷轉(zhuǎn)移，提高傳感器檢測(cè)甲胎蛋白的靈敏度至5.00 pg/mL。

2.3 檢測(cè)其他腫瘤標(biāo)志物

2.3.1 糖類抗原125(CA125)為目前惟一被推薦作為卵巢癌標(biāo)志物的腫瘤標(biāo)志物，在卵巢癌患診斷、療效評(píng)價(jià)及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)中地位明確[15]。Taleat等[16]課題組在聚茴酸修飾的石墨烯絲網(wǎng)印刷電極共價(jià)結(jié)合CA125抗體，在夾心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫測(cè)定。其最終檢測(cè)范圍為5～25 U/mL，靈敏度低至2 U/mL。

2.3.2 CA15-3是乳腺癌最重要的特異性標(biāo)志物。Li等[17]首先報(bào)道了制備靈敏檢測(cè)糖類抗原的無標(biāo)記新型電化學(xué)免疫傳感器方法。與以往傳統(tǒng)免疫傳感器不同，高導(dǎo)電性的氮摻雜石墨烯片修飾電極的設(shè)計(jì)，無需標(biāo)記并顯著增加了電子傳輸。最低檢測(cè)限為0.012 U/mL，線性范圍0.1～20.0 U/mL。

2.3.3 人絨毛膜促性腺激素(HCG)在幾乎所有絨毛膜上皮細(xì)胞癌、70% 的非精原細(xì)胞性睪丸癌可見。Li[18]利用石墨烯和多孔納米金箔能雙重放大電化學(xué)效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，以對(duì)苯二酚為還原指示劑，多孔納米金箔固定HCG，得到了較寬的線性范圍0.5～40.00 ng/mL和較高的靈敏度0.034 ng/mL。

2.3.4 前列腺特異性抗原可作為前列腺癌的特異性標(biāo)記物。Chen等[19]新研發(fā)了一種無標(biāo)記檢測(cè)前列腺特異性抗原的三維電化學(xué)免疫方法。利用高導(dǎo)電性的石墨烯納米金復(fù)合物修飾電極后，該免疫傳感器的電子轉(zhuǎn)移和靈敏度明顯升高至0.59 ng/mL，電流變化的最高水平與對(duì)應(yīng)的濃度之比為5 μA/(ng/mL)。該三維免疫傳感器的制備為免疫傳感器新方法的研究提供了一種很好的借鑒。

2.4 多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè) 測(cè)量單一腫瘤標(biāo)志物往往具有有限的診斷價(jià)值[20]。同時(shí)檢測(cè)多種分析物可以縮短分析時(shí)間，減少檢測(cè)成本，提高測(cè)試效率，具有更重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。Wu等[21]發(fā)明了一種在還原氧化石墨烯/四乙烯五胺修飾的玻碳電極上同時(shí)檢測(cè)CEA和鱗狀細(xì)胞抗原的電化學(xué)免疫法。在夾心免疫基礎(chǔ)上，分別在中性紅峰值電位0.62 V及硫堇峰值電位0.17 V下研究抗原濃度與峰值電流變化的關(guān)系，得到CEA和鱗狀細(xì)胞抗原最低檢測(cè)限分別為0.013 ng/mL和0.010 ng/mL，重復(fù)性好(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.3%、4.8%)。該免疫傳感器開發(fā)的策略為腫瘤標(biāo)志物多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)提供了一種有前途的方法。

3 展 望

石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器為腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的研究提供了一種全新的方法，但是如何大規(guī)模制備結(jié)構(gòu)完整、尺寸和層數(shù)可控的高質(zhì)量石墨烯仍然是當(dāng)前需要重點(diǎn)攻克的課題。鑒于目前關(guān)于石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器的研究大多仍停留在基礎(chǔ)研究階段，如何實(shí)現(xiàn)由基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向高通量、微型化、商業(yè)化方向發(fā)展仍需努力。伴隨著新的化學(xué)修飾方法、摻雜的石墨烯的制備和分子水平功能修飾等技術(shù)的不斷研究與引進(jìn)，石墨烯修飾的電化學(xué)免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的前景。

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腎小管上皮細(xì)胞。有研究表明，長(zhǎng)春西汀另一個(gè)保護(hù)作用機(jī)制就是它能夠清除羥自由基和其他活性氧而發(fā)揮顯著的抗氧化活性，這與本研究結(jié)果相符[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春西汀干預(yù)組腎組織SOD活性升高，MDA水平有所降低，由此表明長(zhǎng)春西汀能夠保護(hù)內(nèi)源性SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，長(zhǎng)春西汀干預(yù)處理能夠降低小鼠腎IR后的炎癥和氧化損傷，保護(hù)腎功能，為臨床預(yù)防治療急性腎損傷提供了新思路。

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