胡振勇，辛海松

(黃驊市人民醫(yī)院骨一科，河北 黃驊061100)

滑膜MMP-3對骨性關(guān)節(jié)炎患者病情的評估價值

胡振勇，辛海松

(黃驊市人民醫(yī)院骨一科，河北 黃驊061100)

目的探討滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)對骨性關(guān)節(jié)炎患者病情的評估價值。方法選取2011年1月至2015年4月收治的骨性關(guān)節(jié)炎患者106例為骨性關(guān)節(jié)炎組，另選取滑膜皺襞綜合征、單純膝關(guān)節(jié)半月板損傷或者截肢的患者30例為對照組。Envision二步法檢測滑膜MMP-3表達(dá)水平。結(jié)果骨性關(guān)節(jié)炎組與對照組MMP-3表達(dá)陽性細(xì)胞率分別為92.45%和20.00%，兩組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；隨著骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度升高，MMP-3表達(dá)水平逐漸升高，骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度與MMP-3表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.765，P=0.021)。結(jié)論MMP-3在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中呈高表達(dá)水平，其表達(dá)水平與病變程度相關(guān)，可作為判斷骨性關(guān)節(jié)炎病情的重要指標(biāo)。

骨性關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3)；表達(dá)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見的非炎性滑膜關(guān)節(jié)退行性疾病，其病因復(fù)雜、發(fā)病率高，主要以關(guān)節(jié)軟骨損壞為病理特征，嚴(yán)重影響患者肢體功能和日常生活[1]。目前，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能與軟骨代謝異常、外傷、免疫、酶對軟骨基質(zhì)的降解等多種因素有關(guān)[2-3]。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases，MMPs)的過度表達(dá)與活性增強(qiáng)在軟骨基質(zhì)的代謝中具有重要作用[4]。本文通過檢測MMP-3在骨性關(guān)節(jié)炎患者不同病變程度滑膜中的表達(dá)水平，分析其在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2015年4月收治的骨性關(guān)節(jié)炎患者106例為骨性關(guān)節(jié)炎組，均行膝關(guān)節(jié)鏡、關(guān)節(jié)置換或截肢手術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；肝、腎功能正常，合并無惡性腫瘤及全身感染性疾病；知情同意。根據(jù)Kellgren和Lawrence X線診斷標(biāo)準(zhǔn)將其分為Ⅰ級(34例)、Ⅱ、Ⅲ級(46例)和Ⅳ級(26例)。另外選取滑膜皺襞綜合征、單純膝關(guān)節(jié)半月板損傷或者截肢的患者30例為對照組。骨性關(guān)節(jié)炎組中男性46例，女性60例；年齡18～83歲，平均(56.5±11.2)歲；病程1～11個月，平均(4.5±2.2)個月。對照組中男性13例，女性17例；年齡22～81歲，平均(55.6±12.1)歲；滑膜皺襞綜合征10例、單純膝關(guān)節(jié)半月板損傷12例、截肢的患者8例。

1.2 方法

1.2.1 MMP-3的檢測[6]采用Envision二步法進(jìn)行MMP-3表達(dá)定位及半定量分析。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。標(biāo)本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，置60℃烤箱60min烤干。經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精梯度水化至蒸餾水。3%過氧化氫室溫處理15min，蒸餾水洗滌2min，微波修復(fù)抗原10min，滴加一抗：MMP-3兔抗人多克隆抗體(Abcam公司產(chǎn)品)用磷酸鹽緩沖液(PBS)按1:100稀釋，每張切片滴加稀釋的一抗50μl，4℃孵育過夜。次日PBS沖洗切片3次，每次3～5min。每張切片滴加辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG50μl，在7℃恒溫孵育30min。PBS沖洗切片3次，每次3～5min。每張切片滴加DAB50μl顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果判定[7]采用半定量積分法進(jìn)行結(jié)果判定。對每張切片陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級，確定陽性強(qiáng)度。MMP-3陽性細(xì)胞胞漿棕黃色或棕褐色顆粒，MMP-3陰性細(xì)胞僅胞細(xì)胞核著藍(lán)色。-、+、++、+++分別記為0分、1分、2分和3分。每張切片隨機(jī)抽取10個高倍鏡下視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%、10%～25%、25%～50%、50%～70%、70%～100%分別記為0分、1分、2分、3分和4分。陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)之和1～3分為MMP-3低表達(dá)，4～7分為MMP-3高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，MMP-3表達(dá)陽性細(xì)胞率比較采用χ2檢驗(yàn)，MMP-3表達(dá)水平與病變程度之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-3表達(dá)情況 MMP3在非骨性關(guān)節(jié)炎患者中呈弱陽性表達(dá)，細(xì)胞外基質(zhì)中可見少許棕色顆粒分布；在骨性關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)多定位于胞漿，可見大量棕色及棕褐色顆粒，見圖1。

圖1 MMP3表達(dá)情況（×400）

2.2 MMP-3表達(dá)陽性細(xì)胞率比較 骨性關(guān)節(jié)炎組與對照組MMP-3表達(dá)陽性細(xì)胞率分別為92.45%和20.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.903，P＜0.01)。

2.3 MMP-3表達(dá)水平與病變程度的關(guān)系 隨著骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度升高，MMP-3表達(dá)水平逐漸升高，骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度與MMP-3表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.765，P=0.021)，見表1。

表1 骨性關(guān)節(jié)炎組患者的MMP-3表達(dá)水平與病變程度的關(guān)系(±s)

表1 骨性關(guān)節(jié)炎組患者的MMP-3表達(dá)水平與病變程度的關(guān)系(±s)

病變程度 例數(shù)MMP-3表達(dá)水平Ⅰ級Ⅱ、Ⅲ級Ⅳ級3446261.82±0.112.18±0.262.52±0.31

3 討 論

MMP-3是MMPs家族的重要成員之一，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的基質(zhì)分解素類，具有降解層粘連蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型膠原的作用。自1962年首次發(fā)現(xiàn)MMP-1以來，MMPs現(xiàn)已成為有25個成員組成的鋅離子蛋白酶超家族，廣泛分布于關(guān)節(jié)炎、牙周炎等多種結(jié)締組織疾病中，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。MMPs被證實(shí)在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

骨性關(guān)節(jié)炎的病理改變主要表現(xiàn)在滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)軟骨下骨等方面。本文對我院收治的106例骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜中的MMP-3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎組與對照組MMP-3表達(dá)陽性細(xì)胞率分別為92.45%和20.00%，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中MMP-3呈高表達(dá)水平?；な潜桓碴P(guān)節(jié)腔內(nèi)側(cè)面的纖維結(jié)締組織，可以分為滑膜內(nèi)層和滑膜下層。骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，滑膜可表現(xiàn)為增生、充血、水腫等，滑液過度分，其中含有基質(zhì)金屬蛋白酶，對軟骨組織產(chǎn)生降解作用。此外，滑膜分泌的炎性介質(zhì)反作用于基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)疾病的發(fā)生，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎。

既往大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜或滑液中表達(dá)升高。李保馳等[2]MMP-3和MMP-13蛋白在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中表達(dá)明顯高于非骨性關(guān)節(jié)炎患者，且MMP-3和MMP-13表達(dá)具有正相關(guān)性，可能作為診斷及判斷骨性關(guān)節(jié)炎的重要指標(biāo)。李守龍等[8]報道稱，膝骨關(guān)節(jié)炎患者M(jìn)MP-3膝內(nèi)側(cè)間室滑膜的表達(dá)高于外側(cè)間室滑膜，為臨床上決定滑膜切除范圍提供了依據(jù)。張杰等[9]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-1與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可用于判斷和診斷骨性關(guān)節(jié)炎。國外學(xué)者證實(shí)MMP-3的mRNA在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜為高水平表達(dá)，而在正常關(guān)節(jié)軟骨和滑膜為低水平表達(dá)[10]。以上結(jié)果均提示MMPs參與了骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中。

本文對骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜的表達(dá)水平與病變程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度升高，MMP-3表達(dá)水平逐漸升高，骨性關(guān)節(jié)炎患者病變程度與MMP-3表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.765，P=0.021)，表明MMP-3在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜的表達(dá)水平與病變程度相關(guān)，可用于判斷患者病情。MMP-3可由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞分泌，以59/57 kU的酶原形式分泌后被蛋白裂解成45 kU和28 kU的活性形式。有研究表明，過度表達(dá)的MMP-3可激活MMPs家族其他成員，放大炎癥效應(yīng)，共同參與降解軟骨基質(zhì)的工型、Ⅱ型膠原、明膠以及纖維連接蛋白等成分，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生[1]。

綜上所述，MMP-3在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中呈高表達(dá)水平，其表達(dá)水平與病變程度相關(guān)，可作為判斷骨性關(guān)節(jié)炎病情的重要指標(biāo)。

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Value of MMP-3 expression level in evaluating the grade of osteoarthritis.

HU Zhen-yong,XIN Hai-song.The First Department of Orthopedics,the People's Hospital of Huanghua City,Huanghua061100,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the value of matrix metalloproteinases3(MMP-3)expression level in the evaluation of the grade of osteoarthritis.MethodsOne hundred and six patients with osteoarthritis in our hospital from Jan.2011 to Apr.2015 were selected as osteoarthritis group,and another30 patients with synovial plica syndrome,knee meniscus injury and amputation were enrolled as control group.Envision two step method was used to determine the MMP-3 expression level at synovium.ResultsThe positive MMP-3 expression rate of osteoarthritis group and control group were92.45%and20.00%,respectively,with significant difference between the two groups(P＜0.01).With the increasing of grade of osteoarthritis,MMP-3 expression level significantly increased.Grade of osteoarthritis was positively correlated with MMP-3 expression level(r=0.765,P=0.021).ConclusionMMP-3 expressed at high level at synovium in patients with osteoarthritis,and its expression level is positively correlated with grade of osteoarthritis.

Osteoarthritis;Matrix metalloproteinases3(MMP-3);Expression

R684.3

A

1003—6350（2015）20—2995—03

2015-05-29)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1090

滄州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號：141302036）

胡振勇。E-mail：13703331719@sohu.com