付 輝，張 靜，吳小磊

(1.唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科，河北 唐山063000；2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，河北 唐山063000)

復(fù)發(fā)型PNS患兒腎組織P-糖蛋白170的表達(dá)及其臨床意義

付 輝1，張 靜2，吳小磊1

(1.唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科，河北 唐山063000；2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，河北 唐山063000)

目的探討復(fù)發(fā)型原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患兒腎組織P-糖蛋白170(P-gp170)的表達(dá)及其臨床意義。方法共選取2012年1月至2013年12月間我院住院診治的58例PNS患兒，包括初發(fā)未用糖皮質(zhì)激素(GC)組13例，復(fù)發(fā)未用GC組18例，復(fù)發(fā)用GC組27例，穿刺取得腎組織，另取12例正常腎組織作為對(duì)照組。采用免疫組化法檢測并比較各組腎組織中P-gp170的表達(dá)，分析P-gp170表達(dá)與復(fù)發(fā)型PNS患兒病程、首次復(fù)發(fā)與初發(fā)間隔時(shí)間、糖皮質(zhì)激素用量的關(guān)系。結(jié)果初發(fā)未用GC組、復(fù)發(fā)未用GC組和復(fù)發(fā)用GC組三組腎組織P-gp170的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而復(fù)發(fā)未用GC組與初發(fā)未用GC組P-gp170的表達(dá)差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，復(fù)發(fā)用GC組P-gp170的表達(dá)又高于復(fù)發(fā)未用GC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。復(fù)發(fā)用GC組中P-gp170表達(dá)與病程、糖皮質(zhì)激素用量呈正相關(guān)(r=0.651，r=0.788，P＜0.05)，而與首次復(fù)發(fā)與初發(fā)間隔時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.794，P＜0.05)。結(jié)論復(fù)發(fā)PNS患兒腎組織中P-gp170高表達(dá)，其表達(dá)與PNS患兒病程、復(fù)發(fā)時(shí)間及糖皮質(zhì)激素用量有關(guān)，對(duì)P-gp170進(jìn)行檢測可有效指導(dǎo)PNS患兒的臨床治療，判斷預(yù)后。

兒童；原發(fā)性腎病綜合征；P-糖蛋白170

原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome，PNS)是小兒常見的一種腎臟疾病，約占小兒腎病綜合征(NS)的90%，其典型臨床表現(xiàn)為“三高一低”即大量蛋白尿、高脂血癥、明顯浮腫、低蛋白血癥[1]。目前PNS的具體病因和發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。雖然糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是國內(nèi)外治療PNS的首選藥物，多數(shù)患兒早期足量應(yīng)用預(yù)后較好，但臨床發(fā)現(xiàn)最初對(duì)GC敏感的患兒在治療一段時(shí)間后卻會(huì)表現(xiàn)出對(duì)GC的耐藥現(xiàn)象，約20%對(duì)GC不敏感的患兒不能得到理想的治療效果。而對(duì)GC耐藥則是引起患兒PNS反復(fù)復(fù)發(fā)，病情遷延不愈主要原因，研究表明激素耐藥型腎病綜合征的復(fù)發(fā)率可達(dá)70%以上[2]，反復(fù)復(fù)發(fā)又可進(jìn)一步導(dǎo)致對(duì)GC的敏感性下降，使臨床后續(xù)治療更加困難，很可能發(fā)展為終末期腎病及腎功能衰竭。因此，盡快找出GC耐藥的原因及病情復(fù)發(fā)的因素極其重要，可為制定合理治療方案，改善預(yù)后提供依據(jù)。而目前對(duì)激素耐藥在通過調(diào)整激素用量、劑型或使用免疫抑制劑等措施的治療效果并不很滿意，且副作用明顯，故激素耐藥是研究的熱點(diǎn)和棘手問題。目前有研究表明作為多藥耐藥基因1(MDR1)的表達(dá)產(chǎn)物之一的P-糖蛋白170(Permeability-glycoprotein170，P-gp170)在激素耐藥型腎病綜合征患兒外周血的表達(dá)高于激素敏感者[3]，但有關(guān)P-gp170在腎組織的表達(dá)研究較少，本研究通過觀察P-gp170在PNS患兒腎組織中的表達(dá)、分布，探討其與GC治療療效及PNS復(fù)發(fā)的關(guān)系，為臨床治療提供有價(jià)值依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2013年12月間我院住院診治的資料完整的58例PNS患兒，診斷均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組西安會(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中男性36例，女性22例，中位年齡5.3歲。分為初發(fā)未用糖皮質(zhì)激素(GC)組13例，復(fù)發(fā)未用GC組18例，復(fù)發(fā)用GC組27例。穿刺取得腎組織，隨訪1年。另取12例因外傷于我院外科行腎切除的正常腎組織作為對(duì)照組，男性7例，女性5例，中位年齡5.5歲。排除既往有腎臟疾病史者，各組間的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究獲得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有研究對(duì)象各取1.0cm×1.0cm×0.5cm大小的腎組織福爾馬林溶液固定，石蠟切片，二甲苯脫水，滅活。采用免疫組織化學(xué)SABC(鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶)法檢測各組腎組織中P-gp170表達(dá)水平，檢測所用試劑盒及鼠抗人抗體P-gp170均購自武漢明德生物科技有限公司，并嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片，嚴(yán)格控制光亮度，用同一臺(tái)顯微鏡并統(tǒng)一拍攝條件，使用Image-Pro Plus6.0彩色圖文分析軟件觀察測定免疫反應(yīng)物，按文獻(xiàn)[5]方法測定每個(gè)觀察視野(×100)A區(qū)域(腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及間質(zhì))的灰度(GA)、陽性產(chǎn)物相的灰度(Gα)及面積密度(AAα)，按公式PU=100×∣Gα-GA∣/[(1-AAα)Gmax]計(jì)算觀察視野中的P-gp170蛋白陽性單位PU值。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組腎小管及腎間質(zhì)P-gp170表達(dá)水平，以及P-gp170表達(dá)與復(fù)發(fā)用GC組患兒的病程、首次復(fù)發(fā)與初發(fā)間隔時(shí)間(＜3個(gè)月、3～6個(gè)月、＞6個(gè)月)、糖皮質(zhì)激素的使用劑量(小劑量、中劑量、大劑量)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.1統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用方差分析，復(fù)發(fā)用GC組數(shù)據(jù)的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織中P-gp170蛋白表達(dá)情況比較 P-gp170在各組腎組織中的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及間質(zhì)表達(dá)，而在腎小球表達(dá)甚少或無表達(dá)，且PNS患兒P-gp170表達(dá)在近曲小管高于遠(yuǎn)曲小管高于腎間質(zhì)(P＜0.05)。在近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及腎間質(zhì)，初發(fā)未用GC組、復(fù)發(fā)未用GC組、復(fù)發(fā)用GC組患兒P-gp170的表達(dá)PU值均明顯高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，而復(fù)發(fā)未用GC組與初發(fā)未用GC組P-gp170的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，復(fù)發(fā)用GC組P-gp170的表達(dá)均明顯高于復(fù)發(fā)未用GC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組腎小管及腎間質(zhì)P-gp170表達(dá)水平比較(±s，PU值)

表1 各組腎小管及腎間質(zhì)P-gp170表達(dá)水平比較(±s，PU值)

組別 近曲小管 遠(yuǎn)曲小管 腎間質(zhì)初發(fā)未用GC組(n=13)復(fù)發(fā)未用GC組(n=18)復(fù)發(fā)用GC組(n=27)正常對(duì)照組(n=12)F值P值23.85±1.1224.63±1.2831.52±1.3710.83±1.09750.3310.00021.53±1.1022.21±1.2628.22±1.3010.24±1.03611.4510.00016.79±1.0917.47±1.2023.57±1.289.62±1.01403.0870.000

2.2 P-gp170表達(dá)與復(fù)發(fā)用GC組患兒臨床指標(biāo)的相關(guān)性 復(fù)發(fā)用GC組P-gp170表達(dá)與患兒病程長短及糖皮質(zhì)激素用量呈正相關(guān)性(r=0.651和r=0.788，均P＜0.05)，而與首次復(fù)發(fā)和初發(fā)間隔時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.794，P＜0.05)，見表2。

表2 復(fù)發(fā)用GC組不同臨床指標(biāo)P-gp170的表達(dá)水平(±s，PU值)

表2 復(fù)發(fā)用GC組不同臨床指標(biāo)P-gp170的表達(dá)水平(±s，PU值)

觀察指標(biāo)P-gp170r值P值病程(年)＜11～2＞2首次復(fù)發(fā)與初發(fā)間隔時(shí)間(月)＜33～6＞6 GC用量小劑量中劑量大劑量0.651＜0.0519.13±1.1722.51±1.2429.93±1.31 -0.794＜0.0529.26±1.3324.83±1.2521.55±1.230.788＜0.0520.08±1.0226.81±1.3333.47±1.35

3 討 論

小兒原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是一組多因素導(dǎo)致的腎小球?yàn)V過膜對(duì)血漿蛋白通透性增高，而引起大量蛋白質(zhì)從尿中流失的臨床綜合征。糖皮質(zhì)激素(GC)是最基本的也是主要的治療藥物之一，PNS患兒對(duì)GC的反應(yīng)性一定程度決定了其預(yù)后。然而部分PNS患兒存在對(duì)GC的抵抗或耐藥，影響了臨床治療效果，會(huì)導(dǎo)致PNS的復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅患兒的生活質(zhì)量。因此，為避免激素耐藥的PNS患兒不必要的大量激素使用及其帶來的副作用，通過有效的客觀指標(biāo)盡早盡快診斷，及時(shí)調(diào)整治療方案，對(duì)控制PNS的復(fù)發(fā)意義重大。在腫瘤化療藥物治療耐藥機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)多耐藥基因(MDR1)編碼的跨膜糖蛋白P-gP170與耐藥有密切關(guān)系。P-gP170具有藥泵功能，能把進(jìn)入細(xì)胞的大多數(shù)化療藥物、激素、蛋白等泵出到細(xì)胞外，從而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，引起細(xì)胞對(duì)藥物的耐受[5]。已有少量研究報(bào)道耐藥型PNS患兒外周血P-gp170表達(dá)高于敏感型PNS，而有關(guān)PNS患兒腎組織的P-gp170表達(dá)情況及其與激素治療效果的關(guān)系研究甚少。腎組織是糖皮質(zhì)激素主要作用的靶器官，故有理由認(rèn)為PNS患兒的部分腎組織可能存在P-gp170的異常表達(dá)，且懷疑與GC耐藥有關(guān)[6]。本研究觀察PNS患兒腎組織P-gp170表達(dá)分布及其與患兒臨床指標(biāo)間的關(guān)系，探討P-gp170在PNS患兒GC耐藥及病情復(fù)發(fā)中的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示P-gp170在PNS患兒腎組織及正常腎組織中的腎小管及間質(zhì)表達(dá)，腎小球幾乎無表達(dá)。PNS患兒P-gp170表達(dá)在近曲小管高于遠(yuǎn)曲小管高于腎間質(zhì)(P＜0.05)，說明P-gp170表達(dá)主要是參與了某些代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄，同時(shí)P-gp170在GC作用的主要部位腎小管的高表達(dá)說明其與GC的反應(yīng)狀態(tài)有一定關(guān)系。初發(fā)未用GC組、復(fù)發(fā)未用GC組、復(fù)發(fā)用GC組患兒P-gp170的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組(均P＜0.05)，而復(fù)發(fā)未用GC組與初發(fā)未用GC組P-gp170的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，復(fù)發(fā)用GC組P-gp170的表達(dá)又高于復(fù)發(fā)未用GC組(P＜0.05)，說明PNS患兒腎組織中P-gp170的表達(dá)升高，且其可能與PNS的復(fù)發(fā)及GC的應(yīng)用有關(guān)，復(fù)發(fā)PNS患兒可能在應(yīng)用GC治療中而產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象；且本研究表明P-gp170表達(dá)與GC用量呈明顯正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，說明可能是應(yīng)用GC后誘導(dǎo)了P-gp170的表達(dá)增加而導(dǎo)致繼發(fā)耐藥，從而進(jìn)一步影響GC的療效。P-gp170可能是PNS患兒GC耐藥的因素之一，這與相關(guān)研究一致[7]。本研究顯示復(fù)發(fā)用GC組的P-gp170表達(dá)與PNS患兒病程呈正相關(guān)，而與首次復(fù)發(fā)和初發(fā)間隔時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)，認(rèn)為PNS患兒腎組織P-gp170的表達(dá)影響其預(yù)后，P-gp170表達(dá)較高的患兒其復(fù)發(fā)可能性加大，病程延長。因此，P-gp170的表達(dá)可反映細(xì)胞內(nèi)GC的水平及患兒對(duì)激素的敏感性。

綜上所述，我們建議在對(duì)PNS患兒進(jìn)行腎組織病理學(xué)檢查的同時(shí)可進(jìn)行腎組織P-gp170表達(dá)的檢測，將有助于判斷PNS患兒對(duì)GC的反應(yīng)性，預(yù)測其臨床療效，并可針對(duì)不同P-gp170水平患兒制定個(gè)性化的治療方案，如應(yīng)用一些能抑制P-gp170轉(zhuǎn)運(yùn)泵功能的藥物等。同時(shí)尚需進(jìn)一步探討P-gp170的表達(dá)與GC應(yīng)用時(shí)間的長短和PNS病理分型的關(guān)系，為深入探討P-gp170在GC耐藥及在PNS復(fù)發(fā)中的作用，尋找臨床有效應(yīng)對(duì)措施提供理論依據(jù)。

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Expression and clinical significance of P-glycoprotein170 in renal tissue in children with relapsed primary nephrotic syndrome.

FU Hui1,ZHANG Jing2,WU Xiao-lei1.1.Department of Pediatric Internal Medicine,Tangshan Maternal and Child Health Care Hospital,Tangshan063000,Hebei,CHINA;2.Department of Clinical Medicine,Tangshan Vocational and Technical College,Tangshan063000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of P-glycoprotein170(P-gp170) in renal tissue of children with relapsed primary nephrotic syndrome(PNS).MethodsFifty-eight children with PNS diagnosed in our hospital from January2012 to December2013 were selected,including13 cases of incipient PNS without glucocorticoid(GC)treatment(incipient PNS without GC group),18 cases of relapsed PNS without GC treatment(elapsed PNS without GC group),27 cases of relapsed PNS with GC treatment(elapsed PNS with GC group),and kidney tissues were collected through puncture.Twelve cases of normal renal tissues were selected as control group.The expression of P-gp170 of renal tissues in all groups were detected by immunohistochemical method,and the correlations between P-gp170 expression and disease course,recurrence time,the dosage of glucocorticoid were analyzed.ResultsThe expression of P-gp170 were higher in incipient PNS without GC group,relapsed PNS without GC group and relapsed PNS with GC group than control group,and the differences had statistical significance(allP＜0.05).P-gp170 expression had no statistically significant difference between relapsed PNS without GC group and incipient PNS without GC group(allP＞0.05),and P-gp170 expression were higher in relapsed PNS with GC group than relapsed PNS without GC group,with statistically significant differences(allP＜0.05).P-gp170 expression were positively correlated with duration,dosage of glucocorticoid in relapsed PNS with GC group(r=0.651,r=0.788,P＜0.05),and was negatively correlated with recurrence time(r=0.794,P＜0.05).ConclusionP-gp170 is highly expressed in renal tissue of children with relapsed PNS.Its expression is closely related with duration,recurrence time and dosage of glucocorticoid.Testing the P-gp170 can effectively guide the clinical treatment of children with PNS and judge the prognosis.

Children;Primary nephrotic syndrome(PNS);P-glycoprotein170

R726.9

A

1003—6350（2015）20—2982—03

2015-04-16)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1086

付 輝。E-mail：fhts15@163.com