彭錦，李鐵嶺，韓麗娜，林曉明，何爽

（1.中國人民解放軍第187中心醫(yī)院心內(nèi)科，海南?？?71100；2.中國人民解放軍總醫(yī)院干部理療科，北京100853；3.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心血管一科，北京100853）

L-NAME對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎的保護(hù)作用

彭錦1，李鐵嶺2，韓麗娜3，林曉明1，何爽3

（1.中國人民解放軍第187中心醫(yī)院心內(nèi)科，海南?？?71100；2.中國人民解放軍總醫(yī)院干部理療科，北京100853；3.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心血管一科，北京100853）

目的觀察NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(EAM)Lewis大鼠模型的治療效果，并探索可能的治療機(jī)理。方法20只Lewis大鼠建立EAM動(dòng)物模型：雙足底注射心肌C蛋白片段和完全弗氏輔佐劑的油狀混合物，腹腔注射百日咳毒素。大鼠隨機(jī)等分為治療組和模型對照組，每組各10只。治療組腹腔注射5 mg·kg-1·d-1L-NAME，從免疫注射術(shù)后第1天開始連續(xù)20 d，1次/d。對照組相同時(shí)間內(nèi)給予相同劑量生理鹽水腹腔注射。治療結(jié)束后第1天處死動(dòng)物，心臟取材，進(jìn)行系列檢測。其中組織病理學(xué)石蠟切片蘇木素-伊紅(HE)染色檢測心肌炎癥分級，免疫組織化學(xué)染色檢測T淋巴細(xì)胞浸潤，天狼星紅染色檢測心肌膠原纖維含量，硝酸還原酶法檢測NO水平，明膠酶譜法檢測膠原酶活性。結(jié)果與對照組比較，L-NAME治療組心肌炎癥級別下降[(3.42±0.31)vs(2.51±0.22)，P＜0.01]、T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)目減少[(28.2±4.6)vs(13.2±1.9)，P＜0.01]、心肌間質(zhì)纖維化級別下降[(2.33±0.26)vs(1.14±0.17)，P＜0.01]、血清NO水平降低[(68.34±8.61)μmol/L vs(45.71±6.53)μmol/L，P＜0.01]，明膠酶活性降低[(254 526±4 729)vs(184 712±3 869)，P＜0.01]。結(jié)論L-NAME抑制EAM病理發(fā)展過程，其機(jī)制可能與通過降低NO水平和明膠酶活性，從而降低心肌炎癥細(xì)胞浸潤，延緩心肌間質(zhì)纖維化有關(guān)。

心肌炎；L-NAME；一氧化氮；基質(zhì)金屬蛋白酶

自身免疫性心肌炎是擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭的主要病因之一。自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis，EAM)大鼠模型病情類似人類免疫性心肌炎向擴(kuò)張性心肌病和心力衰竭發(fā)展的病理過程[1]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)作為一種氣體自由基在心肌炎病理機(jī)制中可能起雙重機(jī)制作用，一方面內(nèi)皮源性NO有抑制炎癥過程的作用；另一方面炎癥過程后期大量生成的NO又加劇炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用[2]。NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,hydrochloride，L-NAME)屬于左旋精氨酸類似物，能夠競爭性抑制一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的活性，從而抑制NO的合成。本研究利用Lewis大鼠免疫注射重組心肌C-蛋白片段建立EAM模型，并使用L-NAME治療，通過活體觀察，檢測心肌炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化，判斷治療效果；并從NO和細(xì)胞外基質(zhì)等方面，探討NO在EAM病理中的生物學(xué)作用，以及L-NAME治療EAM的機(jī)制，為臨床治療EAM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物免疫、分組及給藥6～8周齡Lewis大鼠(購自北京維通利華生物制品所)20只，雌雄不限，SPF級動(dòng)物室培養(yǎng)，建立EAM模型：雙足底注射100 μg/kg心肌C蛋白和2.5 mg/ml完全弗氏佐劑等體積油狀混合物200 μl，腹腔注射1 μg/ml百日咳毒素0.5 ml。大鼠隨機(jī)等分為治療組(n=10)和模型對照組(n=10)。治療組給予100 μg/ml L-NAME(Sigma公司產(chǎn)品)5 mg·kg-1·d-1，腹腔注射，從免疫注射后第1天開始連續(xù)20 d，1次/d。模型對照組相同時(shí)間內(nèi)給予相同劑量生理鹽水腹腔注射。

1.2 取材

1.2.1 血清標(biāo)本在制模后第8天大鼠稱重，第21天心臟取血3 ml置于離心管中，4℃、3 000 r/min離心取上清，-80℃保存，用于檢測NO含量。

1.2.2 心臟組織標(biāo)本免疫注射第21天心臟取材。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉生效后取心臟，電子天平稱量心臟重量(g)。心臟從上向下按照等分成二部分。其中上部分放入4%多聚甲醛固定，用于病理組織學(xué)蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色檢測心肌炎癥積分，天狼星紅染色檢測心肌膠原纖維含量，免疫組織化學(xué)染色檢測心肌T細(xì)胞浸潤；下部分OCT油覆蓋，液氮預(yù)冷的異戊烷中凝固后，-80℃長期保存，冰凍組織切片用于原位明膠酶譜法檢測明膠酶活性。

1.3 臨床分級在免疫后第1周開始測量大鼠體重，觀察大鼠呼吸、毛發(fā)和運(yùn)動(dòng)等，確定臨床評分。臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：1級為呼吸困難或聳毛；2級為呼吸困難和聳毛；3級為死亡。

1.4 炎癥積分檢測心臟組織石蠟薄切HE染色用于炎癥組織學(xué)分級。0級：無炎癥；1級：心肌組織內(nèi)散在分布炎細(xì)胞；2級：炎性細(xì)胞聚集成灶；3級：炎性細(xì)胞浸潤侵犯心肌外膜；4級：部分心肌全層受炎性細(xì)胞浸潤；5級：炎性細(xì)胞心肌內(nèi)廣泛浸潤。

1.5 心肌纖維化積分檢測并測定膠原含量(1)心肌纖維化積分檢測：心臟組織石蠟薄切行0.1%飽和苦味酸天狼星紅染色用于檢測纖維化積分。5 μm切片自動(dòng)染色裝置脫蠟，0.2%磷鉬酸溶液5 min，0.1%飽和苦味酸天狼星紅溶液染色90 min，0.01 N鹽酸分化2 min，常規(guī)梯度酒復(fù)水，二甲苯媒浸，封片。Zeiss Axion Cam MRC5偏振光顯微鏡下觀察，纖維化組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)。0級：無纖維化；1級：少量纖維增生；2級：纖維聚集成片；3級：纖維增生累及心肌外膜；4級：部分心肌全層纖維增生；5級：心肌廣泛纖維化。(2)膠原含量計(jì)算：物鏡20倍放大倍數(shù)下拍照，每個(gè)標(biāo)本照相10張。在同一區(qū)域首先普通光源下拍照，作為心肌總面積；然后偏振光狀態(tài)下拍照，作為心肌纖維含量。NIH J 1.63 image圖象處理軟件，檢測心肌總面積和膠原像素。取其平均值，作為該切片的心肌總面積像素和膠原像素。心肌膠原含量(%)=膠原像素/心肌像素×100%。

1.6 心肌T細(xì)胞浸潤檢測采用SP法，依照廠家產(chǎn)品說明書嚴(yán)格操作。主要試劑：小鼠抗大鼠T細(xì)胞抗原受體α/β(TCRα/β，R73)(美國BD公司)及SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。同時(shí)以PBS代替一抗作陰性對照。物鏡20倍放大倍數(shù)下拍照。每個(gè)標(biāo)本照相10張，在分別計(jì)算每個(gè)視野下R73染色陽性的細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算其均數(shù)。

1.7 NO含量檢測取0.1 ml實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清和0.4 ml混合試劑混勻，37℃準(zhǔn)確水浴60 min?？瞻讓φ战M用0.1 ml雙蒸水代替待測標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)對照組用0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)工作液代替待測標(biāo)本。各組分別加入0.2 ml Buffer C、0.1 ml Buffer D，充分旋渦混勻30 s，室溫靜置40 min，3 500～4 000 r/min，離心10 min，取上清顯色。取各組0.5ml上清中加入0.6 ml顯色劑混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm處，0.5 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。根據(jù)樣品OD值按公式計(jì)算NO含量。

1.8 明膠酶活性測定切厚度10 μm冰凍切片，-20℃保存，使用時(shí)室溫內(nèi)風(fēng)干，滴加40 μg/ml DZ明膠，37℃孵育30 min，PBS清洗，VECTASHIELD封片，LEICATCS SP激光共聚焦顯微鏡下觀察，掃描圖像。圖像用Photoshop和NIH 1.63軟件計(jì)算圖像像素。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件運(yùn)算。心肌組織炎癥積分、間質(zhì)纖維化積分、纖維含量、心肌T細(xì)胞浸潤、血清NO水平以及心肌明膠酶活性數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，方差齊時(shí)采用雙側(cè)Student t檢驗(yàn)，方差不齊采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，α=0.05，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活體觀察模型對照組Lewis大鼠在免疫注射后12～14 d出現(xiàn)呼吸困難和聳毛，L-NAME治療組在免疫注射后12～14 d表現(xiàn)輕度呼吸困難或聳毛。

2.2 心肌組織炎癥積分與模型對照組比較，L-NAME治療組大鼠心肌組織石蠟切片顯示心肌組織炎癥積分下降，具體結(jié)果見表1，治療前后心肌HE染色對比圖像見圖1和圖2。

表1 L-NAME對EAM大鼠心肌炎癥分級、T淋巴細(xì)胞、纖維化分級和含量的影響(±s)

表1 L-NAME對EAM大鼠心肌炎癥分級、T淋巴細(xì)胞、纖維化分級和含量的影響(±s)

組別對照組( n = 1 0 ) L -N A M E組( n = 1 0 )炎癥分級3 . 4 2 ± 0 . 3 1 2 . 5 1 ± 0 . 2 2 T淋巴細(xì)胞2 8 . 2 ± 4 . 6 1 3 . 2 ± 1 . 9纖維化分級2 . 3 3 ± 0 . 2 6 1 . 1 4 ± 0 . 1 7纖維含量( % ) 8 . 1 2 ± 1 . 1 5 5 . 4 7 ± 0 . 9 2檢驗(yàn)值P值3 . 9 5＜0 . 0 0 1 8 . 6 1＜0 . 0 0 5 . 7 4＜0 . 0 0 5 . 8 2＜0 . 0 0

圖1 L-NAME對EAM大鼠心肌炎癥分級、T淋巴細(xì)胞、纖維化分級和含量的影響

圖2 HE染色顯示L-NAME治療組(右圖)和模型對照組(左圖)心肌炎大鼠心肌炎癥積分(×20)

2.3 心肌T淋巴細(xì)胞浸潤與模型對照組比較，L-NAME治療組大鼠心肌免疫組織化學(xué)染色顯示T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)目減少。具體結(jié)果見表1，治療前后心肌T淋巴細(xì)胞浸潤免疫組織化學(xué)染色見圖1和圖3。

2.4 心肌間質(zhì)纖維化積分及纖維含量與模型對照組比較，L-NAME治療組大鼠心肌組織天狼星紅染色顯示心肌間質(zhì)纖維積分和纖維含量減少。具體結(jié)果見表1，治療前后心肌間質(zhì)纖維化天狼星紅染色對比圖像見圖1和圖4。

圖3 免疫組織化學(xué)顯示L-NAME治療組(左圖)和模型對照組(右圖)心肌炎大鼠心肌T淋巴細(xì)胞浸潤(×20)

圖4 苦味酸天狼星紅染色顯示L-NAME治療組（左圖）和模型對照組(右圖)心肌炎大鼠心肌間質(zhì)纖維含量(×20)

2.5 血清NO水平與模型對照組比較，L-NAME治療組大鼠硝酸還原酶法檢測血清NO水平降低，具體結(jié)果見表2和圖5。

表2 L-NAME對EAM大鼠心肌iNOS mRNA、iNOS活性、NO濃度和膠原酶的影響(±s)

表2 L-NAME對EAM大鼠心肌iNOS mRNA、iNOS活性、NO濃度和膠原酶的影響(±s)

組別對照組(n=10) L-NAME組(n=10)檢驗(yàn)值P值NO(μmol/L) 68.34±8.61 45.71±6.53 18.39＜0.00膠原酶254526±4729 184712±3869 2380.92＜0.00

圖5 L-NAME對EAM大鼠血清NO濃度和心肌膠原酶的影響

2.6 明膠酶活性檢測與模型對照組比較，L-NAME治療組大鼠明膠酶譜法測定明膠酶活性降低，具體結(jié)果見表2和圖5，治療前后明膠酶活性對比見圖6。

圖6 膠酶譜法顯示L-NAME治療組（左圖）和模型對照組(右圖)肌炎大鼠明膠酶活性(×40)

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫注射心肌自身抗原建立自身免疫性心炎動(dòng)物模型是一種常用的研究方法。心肌C蛋白是心肌肌凝蛋白結(jié)合蛋白的一種，與心肌肌凝蛋白比較，具有更強(qiáng)致心肌炎作用[3]。

飽和苦味酸天狼星紅染色，偏振光顯微鏡下可以顯示心肌間質(zhì)纖維。心臟間質(zhì)膠原主要為Ⅰ、Ⅲ膠原相互聯(lián)結(jié)組成，心肌Ⅰ型膠原纖維顯示黃色或紅色強(qiáng)的雙折光性，負(fù)責(zé)維持心肌張力；心?、笮湍z原纖維顯示綠色弱的雙折光性，負(fù)責(zé)心肌彈性回縮儲(chǔ)備能量。本研究對照組心肌天狼星紅染色證實(shí)大鼠免疫注射后3周時(shí)心肌纖維化已經(jīng)出現(xiàn)，特點(diǎn)是Ⅰ型膠原面積和含量較Ⅲ膠原增加更多；心肌內(nèi)、外膜下和血管周圍纖維化更突出。纖維化過程中的膠原纖維類型比例平衡的改變，導(dǎo)致心臟彈性和張力改變。

自身免疫性心肌炎的機(jī)理是抗原遞呈細(xì)胞向T細(xì)胞遞呈免疫注射的心肌自身抗原和提供共刺激分子，使T細(xì)胞激活，啟動(dòng)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等心肌局部浸潤破壞心肌，Th2等刺激機(jī)體產(chǎn)生自身抗體[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇心肌T淋巴細(xì)胞作為衡量心臟免疫功能激活狀態(tài)指標(biāo)。Αβ T細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群，R73是其表面特異性標(biāo)志。

NO是一種重要的調(diào)節(jié)生理功能的氣體自由基，它是由NOS催化左旋精氨酸而合成的。NO具有本身生物功能和細(xì)胞毒性兩面性。正常情況下，NO由構(gòu)成型一氧化氮合酶(Constitutive nitric oxide synthase，cNOS)催化而成，濃較低，發(fā)揮生理作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，低活性狀態(tài)下的iNOS被激活催化左旋精氨酸生成濃度較高NO[5]。NO穿過細(xì)胞膜和線粒體膜等生物膜，修飾蛋白的巰基、血紅素輔基、鐵硫中心及細(xì)胞膜磷脂等，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體的作用或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，造成心肌損傷[6-7]。另外NO可誘發(fā)線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷從而激活了炎性細(xì)胞[8]。NO還可以和超氧陰離子自由基快速結(jié)合，生成過氧亞硝酸鹽損傷生物體[9]。

近年來研究表明，基質(zhì)蛋白酶(Matrix metalloprotein，MMP)在心肌炎發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，抑制該酶可以阻斷對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而阻斷炎癥的蔓延和發(fā)展[10]。但關(guān)于L-NAME與MMP關(guān)系的研究比較少。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)L-NAME治療能降低心肌炎大鼠心肌MMP活性。

綜上所述，NO對于EAM病情發(fā)展發(fā)揮重要作用，L-NAME可以通過降低NO濃度以及降低MMP活性，從而緩解心肌炎心肌炎癥和心室重構(gòu)。

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Protective effect of L-NAME on experimental autoimmune myocarditis.

PENG Jin1,LI Tie-ling2,HAN Li-na2, LIN Xiao-ming1,HE Shuang3.1.Department of Cardiology,the 187thHospital of Chinese PLA,Haikou 571100,Hainan, CHINA;2.Department of Physiotherapy for Cadres,the General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,CHINA;3.First Department of Cardiovascular Internal Medicine,the General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,CHINA

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on experimental autoimmune myocarditis(EAM)in Lewis rats,and to explore the possible therapeutic mechanism.MethodsTwenty EAM Lewis rats were treated by injection of myocardial C protein emulsified in completed Freund adjuvant in double footpad and intraperitoneal injection of pertussis toxin.EAM Lewis rats were divided into the treatment group and control group(each with 10 cases).In the treatment group,the treatment protocol was intraperitoneal administration of L-NAME(5 mg·kg-1·d-1)after immunization for 20 days.While in control group the same dose of normal saline was intraperitoneally injected in the same period of time.After experiment at the designate time point,the rats were euthanatized,and their hearts were harvested and tested.Paraffin sections were used for hematoxylin and eosin(HE)stain to determine the inflammation score,for immunohistological stain to determine the infiltration of T lymphocytes,and for picrosirius stain to determine fibrosis score and collagen content.Nitrate reductase method was used to detect serum NO level and gelatin zymography assay to detect the activity of gelatinase.ResultsThe inflammation score in cardiac paraffin slides[(3.42±0.31)vs(2.51±0.22),P＜0.01],infiltration of T lymphocytes[(28.2±4.6)vs(13.2±1.9),P＜0.01],myocardial interstitial fibrosis score[(2.33±0.26)vs(1.14±0.17),P＜0.01],serum NO level[(68.34±8.61)μmol/L vs (45.71±6.53)μmol/L,P＜0.01]and activity of gelatinase[(254 526±4 729)vs(184 712±3 869),P＜0.01]in treatment group were all significantly lower than in control group.ConclusionL-NAME plays an important role in the pathogenesis of autoimmune myocarditis,and its mechanism may be related to the decrease of serum NO level and gelatinase activity in decreasing myocardial inflammatory cells infiltration and delaying myocardial interstitial fibrosis.

Myocarditis;L-NAME;Nitric oxide;Matrix metalloproteinase

R542.2+1

A

1003—6350（2015）01—0011—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0004

2014-06-26)

中國人民解放軍總醫(yī)院臨床科研扶持基金（編號：2012FC-TSYS-2024）；海南省醫(yī)學(xué)普通科研立項(xiàng)課題（編號：瓊衛(wèi)2012PT-66）；三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：YW1306）

李鐵嶺。E-mail：ltl301@2008.sina.com；韓麗娜。E-mail：hanlina3399111@sina.com