胡亞卓，夏 征，韓志濤，張紅紅，王建華，耿 淼，孟秀梅 （.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學研究所病理生理室，衰老及相關疾病研究北京市重點實驗室，北京 00853;.山東青島9436部隊衛(wèi)生隊，山東青島 66）

老年、高齡及長壽老人肝脾組織基因組DNA含量的變化及比較

胡亞卓1，夏 征1，韓志濤1，張紅紅1，王建華1，耿 淼1，孟秀梅2（1.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學研究所病理生理室，衰老及相關疾病研究北京市重點實驗室，北京 100853;2.山東青島94362部隊衛(wèi)生隊，山東青島 266111）

目的 觀察尸檢老年、高齡及長壽老人肝、脾組織基因組DNA含量的變化及差異，探討衰老進程中DNA含量的變化規(guī)律并為今后的衰老相關研究提供實驗數(shù)據(jù)。方法 選取24 h內(nèi)老年尸檢（≥65歲）低溫（－80℃）保存的肝組織35例和脾組織33例，按照年齡分為3組:65～79歲組、80～89歲組、≥90歲組（其中包括百歲老人2例）;低溫（－80℃）保存的肝、脾組織用試劑盒提取基因組DNA，紫外光譜法測定肝脾組織DNA含量，并進行比較分析。結果 肝組織DNA含量:與65～79歲組（1.464±0.488）mg/mL比較，80～89歲組（0.310±0.286）mg/mL顯著降低（P ＜0.05）;且≥90歲組（1.147±0.333）mg/mL 的 DNA 含量顯著高于80～89歲組（P＜0.05）。脾組織基因組 DNA含量:與65～79歲組（1.723±0.726）mg/mL比較，80～89歲組（0.938±0.589）mg/mL顯著降低（P＜0.05）;且≥90歲組（1.688±0.963）mg/mL的DNA含量顯著高于80～89歲組（P＜0.05）。同一尸檢者肝、脾組織DNA含量比較:肝組織平均DNA含量（0.856±0.658）mg/mL顯著低于脾組織平均DNA含量（1.414±0.852）mg/mL（P＜0.05）。結論 老年人肝、脾組織基因組DNA含量隨增齡而降低;90歲以上肝、脾組織DNA的含量均有所增加;同一尸檢者肝組織DNA含量顯著低于脾組織DNA含量，提示不同臟器組織DNA含量存在差異。

老年;肝;脾;基因組DNA;尸檢

遺傳物質(zhì)在遺傳、變異、代謝、調(diào)控等方面起著重要作用，是人類衰老相關疾病研究的對象。隨著年齡的增長，機體各器官組織逐漸發(fā)生退行性變化，感染疾病、癌癥的發(fā)病率和病死率相應增高。而肝和脾作為機體重要的代謝和免疫器官，其功能隨增齡而變化，很大程度上影響生存。因此，我們通過對尸檢的不同年齡老年人的肝和脾組織基因組DNA含量研究，以期從分子水平來分析器官衰老的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

選取解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學研究所老年組織庫2007年至2010年的42例老年尸檢者（≥65歲）正常肝、脾臟組織，其中肝組織35例和脾組織33例，組織標本是嚴格控制在死亡24 h內(nèi)取材并在－80℃條件下保存。尸檢捐獻者均有知情同意書。組織標本排除了可能影響DNA的相關疾病及死因（癌癥、血液病及遺傳性疾病等），盡可能減小由于疾病及不同死因可能所致的對細胞核DNA降解的影響［1］。根據(jù)老年期階段劃分的標準分為3組:65～79歲組（老年期）14例，80～89歲組（高齡老年期）16例，≥90歲以上組（長壽老年期）12例（包括2例百歲老人）。尸檢者一般臨床特點（表1）。

1.2 方法

1.2.1 組織基因組DNA的提取 為避免試驗中操作的誤差，每次隨機選取不同組樣本，盡量避開有血管及被膜的部位，稱取組織約100 mg放入－80℃冰箱（日本三洋公司MDFU52V）保存，置于 1.5 mL 的離心管內(nèi)，加入 180 μl的 Buffer ATL（QIAGEN公司），微量電動勻漿器充分勻漿，40 μl的Proteinase K，56℃消化48 h，90℃高溫蛋白變性1 h，依次加入RNase、Buffer AL、100% 乙醇、Buffer AW1、Buffer AW2，每次7 000×g，2 min常溫離心過離心柱，最后Buffer ATE溶解DNA于自備離心管內(nèi)，－20℃保存。

表1 尸檢者一般臨床特點

1.2.2 紫外光譜法分析基因組DNA濃度 用紫外分光光度計（日本島津公司UV-2550），微量比色杯（100 μl）比色，測定DNA濃度、OD260、OD280及DNA光譜圖。DNA的 OD260和OD280的比值，可以反應提取DNA的品質(zhì)，一般在1.7～1.9之間表明得到的是較為理想的結果，光譜圖直觀地顯示出結果的真實性和可靠性。DNA樣本均取3 μl原液，加87 μl雙蒸水稀釋，上機檢測。

1.2.3 基因組DNA片段檢測 2%瓊脂糖凝膠電泳（電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品），DNA 原液上樣量 7 μl（約 200 μg），Marker 5 μl（Takara公司 DL2 000），1 × TAE（pH=8.0）溶解瓊脂糖（sigma公司），100 V快速進膠后，60 V恒壓走膠，約30 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相（上海天能公司生產(chǎn)的GIS-1000）。1.2.4 PCR 檢測 DNA 質(zhì)量 引物 VDR-Fok I分別為:5’-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3’和5’-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3’（上海生工生物有限公司），PCR反應體系試劑盒（天根生物有限公司KT205），2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 統(tǒng)計學處理

SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組計量資料比較采用t檢驗;多組計量資料比較采用方差分析。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫外光譜法測定

2.1.1 基因組DNA檢測值 肝組織結果顯示:80～89歲組基因組 DNA 濃度（0.310±0.286）mg/mL，與 66～79歲組（1.464 ±0.488）mg/mL、≥90 歲組（1.147 ± 0.333）mg/mL 比較，顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;而66～79歲組與≥90歲組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。脾臟結果顯示:80～89歲組基因組DNA濃度（0.938±0.589）mg/mL，與66～79 歲組（1.723±0.726）mg/mL、≥90 歲組（1.688 ±0.963）mg/mL比較，顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;而66～79歲組與≥90歲組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。雖然肝脾基因組DNA濃度在66～79歲組及≥90歲組比較差異無統(tǒng)計學意義，但能看出數(shù)值存在隨齡變小的趨勢。

表2 不同年齡組肝組織基因組DNA含量（±s，mg/mL）

表2 不同年齡組肝組織基因組DNA含量（±s，mg/mL）

*:與80～89歲組比較，P ＜0.05

組別 n OD260 OD280 DNA濃度OD260/OD280 65 ～79 歲 12 1.125 ±0.351 0.602 ±0.180 1.464 ±0.488*1.858 ±0.076 80 ～89 歲 11 0.247 ±0.207 0.162 ±0.100 0.310 ±0.286 1.399 ±0.258≥90 歲 12 0.879 ±0.239 0.479 ±0.118 1.147 ±0.333*1.795 ±0.159

表3 不同年齡組脾組織基因組DNA含量（±s，mg/mL）

表3 不同年齡組脾組織基因組DNA含量（±s，mg/mL）

*:與80～89歲組比較，P ＜0.05

組別 n OD260 OD280 DNA濃度OD260/OD280 65 ～79 歲 7 1.064 ±0.527 0.510 ±0.239 1.723 ±0.726*2.059 ±0.147 80 ～89 歲 14 0.709 ±0.435 0.360 ±0.224 0.938 ±0.589 2.028 ±0.309≥90 歲 12 1.287 ±0.742 0.661 ±0.400 1.688 ±0.963*1.973 ±0.167

2.2 組織基因組DNA品質(zhì)檢測

選取尸檢者脾和肝的基因組DNA樣本，進行光譜測定。光譜圖橫坐標為波長（nm），縱坐標為OD值（mg/mL），圖1a、b均顯示出在260 nm處有最大吸收值。

圖1 組織紫外吸收基因組DNA光譜

2.3 組織基因組DNA片段檢測及DNA質(zhì)量檢測

觀察基因組DNA片段的情況，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，顯示出基因組DNA條帶（圖2）。擴增后PCR檢測DNA質(zhì)量顯示出PCR產(chǎn)物條帶（圖3）。

圖2 肝、脾組織基因組DNA電泳

2.4 肝、脾基因組DNA含量的比較

比較同時選取同一肝組織、脾組織的32例尸檢者，顯示肝組織平均DNA含量（0.877±0.658）mg/mL，顯著低于脾組織平均 DNA 含量（1.453 ±0.867）mg/mL，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

圖3 肝、脾VDR基因PCR產(chǎn)物電泳

3 討論

衰老是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應激能力下降，結構、組分逐步退行性變，趨向死亡的不可逆轉的現(xiàn)象［2］。衰老的過程漫長而復雜，要到老年期通過系統(tǒng)功能失調(diào)、器官功能衰退等變化逐漸表現(xiàn)出來。影響衰老的因素很多，遺傳、各種社會因素、營養(yǎng)、疾病、環(huán)境及精神狀態(tài)等都起著一定的作用，目前還沒有一種理論能解釋所有的衰老現(xiàn)象。肝、脾作為人體最重要的代謝解毒和免疫器官之一，其功能的減退也和衰老密切相關。

遺傳物質(zhì)DNA作為生物信息的源泉，控制著生命體的形成、生長、發(fā)育、成熟的全過程。它與衰老理所當然有著密切的聯(lián)系，肝脾器官功能減退與DNA改變也密切相關。多項研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)無論是人類還是老鼠，線粒體DNA隨年齡的增加而缺失，尤以腦部最為明顯［3］。隨著年齡的增加，人類肝線粒體DNA隨年齡增加而缺失，并與線粒體功能下降及氧化應激相關，對衰老發(fā)展起到重大的作用［4］。

過往研究多集中在線粒體DNA，針對人類衰老與基因組DNA變化的研究尚缺乏。基于上述理論及研究，我們設想基因組DNA含量變化也可能與衰老和長壽有相關性。我們對不同年齡階段老年人尸檢肝脾組織基因組DNA含量進行研究。對提取的器官基因組DNA進行品質(zhì)檢測，紫外光譜檢測DNA純度較為理想，PCR VDR-Fok I基因片段檢測DNA的完整性也較好，提取的DNA可滿足實驗的要求。研究結果顯示，在肝脾組織中，65～79歲老年人基因組DNA含量均顯著高于80～89歲老年人，提示老年人隨年齡的增長，基因組 DNA為之減少。這與 Cui等［4］對肝線粒體DNA的研究結果相似。目前針對人脾組織進行基因組DNA檢測的相關研究缺乏。有動物實驗通過測定不同日齡果蠅DNA的含量變化發(fā)現(xiàn)，1日齡的雄果蠅從每100 mg干組織147 g下降到102 g［5］。DNA損傷積累學說認為隨年齡的增長，細胞DNA的合成能力和DNA的修復功能均下降，老年細胞的DNA復制能力也明顯低于年輕細胞，DNA損傷在含量上表現(xiàn)出減少的現(xiàn)象，這可能是本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長基因組DNA減少的原因。

但是本研究結果同時顯示超過90歲老年人的DNA含量卻顯著高于80～89歲老年人。目前未見相關報道，但是有與長壽老人相關的反常發(fā)現(xiàn)。Zheng［6］的研究證實，90歲以上的長壽老人與一般老年人相比確實存在某些等位基因的差異，這些等位基因的差異使90歲以上老人患某些疾病的概率降低;耿艷等［7］研究發(fā)現(xiàn)90歲以上的老年人腎臟CaBP表達反而高于80～89歲老人，也提示了90歲以上的長壽老年人存在著特殊性;吳青等［8］在對大樣本骨密度相關檢測研究也發(fā)現(xiàn)90歲組大多數(shù)值有增高的趨勢。本研究結果的差異考慮可能與90歲以上的長壽老年群體的分子差異有關。有研究顯示，衰老及長壽基因、端粒、線粒體DNA單倍型和DNA甲基化等質(zhì)變都會影響衰老進程［9］。在衰老過程中，DNA損傷在含量上表現(xiàn)出減少的現(xiàn)象，某種意義上說，在一定程度上是因為削弱了DNA修復與復制的能力，導致了機體衰老［10］。同樣，90歲以上的長壽老年群體可能因為長壽基因、端粒及外環(huán)境等原因，在延長壽命的同時保持了DNA修復能力，延緩了細胞的衰老，所以在一定程度上減少了DNA數(shù)量的損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)同一尸檢者肝組織DNA含量顯著低于脾組織DNA含量，提示不同臟器組織DNA含量存在差異。究其可能原因有:①血－脾屏障結構發(fā)揮著重要作用，使得機體很少受到內(nèi)、外環(huán)境損傷，并且我們在尸檢過程中也很少發(fā)現(xiàn)在脾臟中有較為明顯的病變（如腫瘤），保證了脾臟DNA的完好性;②脾臟內(nèi)充滿了大量的淋巴細胞，在同一重量下，主要存在于細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)基因組DNA，推測也會相應含量增加;③既往有研究顯示脾細胞核DNA隨死亡時間延長呈現(xiàn)較好的下降梯度，而肝臟則由于自溶較快，死后6 h細胞核DNA含量已很低［11］，影響了肝脾DNA含量的比較。

人體衰老過程是人體內(nèi)部環(huán)境各因素間、人體與外環(huán)境各因素間在生命活動的過程中不斷相互作用、相互影響的綜合性結果，衰老的原因是多方面的，衰老的機理也是極為復雜的。本研究尸檢標本稀有，具有一定局限性。既往有研究提示人器官DNA含量隨死亡時間增加而降低［11］。由于實際條件限制，本研究尸檢時間未能嚴格控制，不能避免死亡時間對DNA溶解的影響。90歲以上的長壽人群是否有著其分子機制的特殊性也有待進一步研究。本研究為不同年齡老年人的肝脾DNA含量提供了參考數(shù)據(jù)，為以后的衰老相關研究提供了實驗數(shù)據(jù)。

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（編輯:左艷芳）

Comparison of genomic DNA content of liver and spleen tissue for different age of elderly

HU Ya-zhuo1，XIA Zheng1，HAN Zhi-tao1，ZHANG Hong-hong1，WANG jian-hua1，GENG Miao1，MENG Xiu-mei2（1.Institute of Geriatrics，Chinese PLA General Hospital，Key Laborarory of Normal Aging and Geriatrics，Beijing 100853;2.Sanitary Corps in 94362 Troops of PLA，Qingdao Shandong 266111，China）

ObjectiveTo investigate the change of genomic DNA of liver and spleen tissue for different age of the elderly，and provide the experimental data for aging-related research.Methods35 livers and 33 spleens of autopsied samples preserved in refrigerator at－80 ℃ were divided into 3 groups according to age:age 65y to 79y，age 80y to 89y，age≥90y.The content of DNA in liver and spleen was determined by ultraviolet absorbent method.ResultsCompaired with age 80y to 89y（0.310 ±0.286）mg/mL，the content of DNA in liver was significant higher at age 65y to 79y（1.464 ±0.488）mg/mL and age ≥ 90y（1.147 ±0.333）mg/mL（P ＜0.05）;Compared with age 80y to 89y（0.938 ±0.589）mg/mL，the content of DNA in spleen was significant higher at age 65y to 79y（1.723 ±0.726）mg/mL and age≥90y（1.688 ±0.963）mg/mL（P ＜0.05）.The content of DNA was significant lower in liver（0.856 ±0.658）mg/mL than that in spleen（1.414 ±0.852）mg/mL.ConclusionThe content of DNA in human liver and spleen tissue may be decrease along with aging.The content of DNA in the group at age≥90y may be increase.There were some differences between different viscera tissue in content of DNA.

elderly;liver;spleen;genomic DNA;autopsy

R394.5

A

1672-5042（2015）02-0175-04

10.11659/jjssx.11E014002

北京市自然科學基金（7122170）

張紅紅，E-mail:zhanghh301@sina.com

2014-11-03

2014-12-05