戰(zhàn)偉超，李辰雨，徐世艾 *，林 劍

（1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中最豐富的蛋白成分[1]，占血漿總蛋白的60%，每升成人血液中約有40 g 白蛋白，占血清總蛋白的（58±4）%[2-3]。人血清白蛋白不僅在中國，在世界上都擁有巨大的市場[4]，其主要作用是維持血液正常滲透壓，同時(shí)也是運(yùn)輸外源性和內(nèi)源性物質(zhì)必不可缺的載體[5-6]；最新研究還發(fā)現(xiàn)人血清白蛋白與CD4受體形成的融合蛋白（HSACD4），有望成為阻止艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的阻斷劑[7]：這種融合蛋白能夠阻斷艾滋病病毒感染CD4+淋巴細(xì)胞的途徑[8]，因此可以將其作為一種特效藥進(jìn)行更深層次的研究。當(dāng)前，白蛋白類藥物制劑多數(shù)來源于血液的直接提取[9-11]，但是由于檢測技術(shù)的不完善和血液來源的不穩(wěn)定性及缺乏性，極易導(dǎo)致使用者感染艾滋病病毒或其他可以通過血液傳播的疾病[12]。不僅僅如此，如果只是從血液中提取人血清白蛋白用于醫(yī)用，是遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場的巨大需求的[13-15]，因此尋找一種新型的、安全的、可以大量生產(chǎn)白蛋白的方法迫在眉睫。采用轉(zhuǎn)基因非誘導(dǎo)型畢赤氏酵母（Pichia pastoris）表達(dá)重組人血清白蛋白（recombinant HSA，rHSA），與目前文獻(xiàn)報(bào)道的廣泛采用的甲醇誘導(dǎo)型畢赤氏酵母[16]相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：首先該菌株發(fā)酵過程中不需要添加甲醇誘導(dǎo)劑[17]，這種優(yōu)勢降低了發(fā)酵過程中補(bǔ)料的危險(xiǎn)系數(shù)，減少了染菌的可能性，產(chǎn)品的分離純化可實(shí)現(xiàn)無污染排放；其次是在其發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源以葡萄糖為主，降低了甘油的使用量，能夠有效的降低生產(chǎn)成本。另外該轉(zhuǎn)基因非誘導(dǎo)型畢赤氏酵母在構(gòu)建過程中將目的基因插入到表達(dá)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白序列的前端，從理論上講該工程菌表達(dá)的白蛋白應(yīng)該是隨著菌體的生長的而進(jìn)行的，整個(gè)發(fā)酵周期明顯縮短。

本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因非誘導(dǎo)型畢赤氏酵母為菌株，研究了該菌株在發(fā)酵過程中的生長規(guī)律、pH值的變化規(guī)律、人造血清白蛋白的產(chǎn)生規(guī)律等，為利用轉(zhuǎn)基因非誘導(dǎo)型畢赤氏酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)重組血清白蛋白提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

轉(zhuǎn)基因非誘導(dǎo)型畢赤氏酵母菌株（Pichia pastoris）NCY-1：山東大學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)研究中心構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂30 g/L。

種子培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

搖瓶培養(yǎng)基：酵母提取物20 g/L，葡萄糖40 g/L，山梨醇15 g/L，甘油15 g/L，KH2PO42 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.10 g/L，營養(yǎng)鹽0.10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物40 g/L，葡萄糖40 g/L，山梨醇30g/L，KH2PO42g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.10g/L，營養(yǎng)鹽10mL/L（單獨(dú)滅菌），消泡劑1 mL/L。

營養(yǎng)鹽：ZnSO4·H2O 20 g/L，MgSO4·7H2O 40 g/L，MnSO4·H2O 10 g/L。

1.1.3 化學(xué)試劑

酵母浸粉：FM888 安琪酵母股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

10JSA全自動(dòng)代謝流發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；DK-98-11多功能萬用爐：天津泰斯儀器有限公司；Waters 1525液相色譜儀：美國Waters公司；Anke TKL-5-A離心機(jī)：上海標(biāo)儀儀器有限公司；Motic BA310雙目顯微鏡：北京汗盟紫星儀器儀表有限公司；AR1530電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；G180TW全制動(dòng)高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；XB-K-25型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

按10%的裝液量，分別取2個(gè)3 L的錐形瓶裝入300 mL的種子液，121 ℃、20 min、0.12 MPa滅菌后，在超凈工作臺(tái)上分別用接種針接入一環(huán)菌，放入恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min、30 ℃培養(yǎng)16 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

按10%的裝液量，在3 L錐形瓶中裝入300 mL的發(fā)酵液，121 ℃、20 min、0.12 MPa滅菌后，在超凈工作臺(tái)上按10%的接種量接種，放入恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min、30 ℃培養(yǎng)70 h。

1.3.3 機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)

在挑取一定量的菌分別接種到兩個(gè)3 000 mL的錐形瓶中，裝液量為300 mL，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)16～18 h后，按10%體積比的接種量接種到10 L的機(jī)械式攪拌發(fā)酵罐中，控制通風(fēng)比為1∶0.7，罐壓0.02 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min，溫度30 ℃發(fā)酵90 h。

1.3.4 NCY-1菌株發(fā)酵液對白蛋白的水解

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲醇誘導(dǎo)型菌株在合成白蛋白的過程中能夠分泌蛋白酶并將發(fā)酵液中的白蛋白水解[13]，導(dǎo)致發(fā)酵后期白蛋白濃度下降。盡管該菌株為非誘導(dǎo)型，但是也可能存在同一現(xiàn)象，為此設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。

取一定體積的發(fā)酵液，在5 500 r/min條件下，常溫離心10 min分離掉發(fā)酵液中的酵母細(xì)胞。分別取20 mL上清液，一份準(zhǔn)確直接加入1.00 g的牛血清白蛋白，一份加熱到100 ℃保溫10 min滅掉酶活后冷卻到常溫，再加入1.00 g牛血清白蛋白。另取20 mL新配的發(fā)酵液加入1.00 g牛血清白蛋白作為空白對照。將上述3份溶液同時(shí)放在30 ℃水浴鍋中保溫10 h后分別測其溶液中殘留的白蛋白含量。

1.3.5 分析方法

（1）菌體濃度：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法[18]。

（2）重組人血清白蛋白檢測方法[19]。

重組人血清白蛋白采用高效液相色譜法測定，色譜條件如下：

流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），1%異丙醇，0.05%三氮化鈉（NaN3）；凝膠色譜柱：TOSOH TSK-GEL G3000SW（7.8 mm×30 cm）；流速0.6 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：準(zhǔn)確稱取0.10 g的牛血清白蛋白用去離子水定容于100 mL容量瓶配制成為1 g/L牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別取不同質(zhì)量濃度的稀釋液20 μL進(jìn)樣，得出不同的峰面積并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）其他指標(biāo)

葡萄糖的含量采用費(fèi)林試劑滴定法[20]；白蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[21]；銨根離子（NH4+）含量采用靛酚藍(lán)-分光光度法測定[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積（x）為橫坐標(biāo)，牛血清蛋白質(zhì)量濃度（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=19.791 0x+4.580 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of BSA

2.2 10 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果

2.2.1 菌體濃度及葡萄糖量對rHSA的影響

圖2 rHSA分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Experimental results of rHSA batch fermentation

由圖2可知，該基因工程菌在前8 h為延滯期，此時(shí)菌體數(shù)目基本保持不變，發(fā)酵液中白蛋白含量為0；8 h后菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體大量增殖，菌體開始不斷地代謝碳源，將發(fā)酵液鏡檢觀察到發(fā)酵液中的畢赤氏酵母多方位出芽，并且存在大量的體型較小的“小”酵母；30 h前，發(fā)酵液中存在rHSA但含量極低，在36 h時(shí)，對數(shù)生長期結(jié)束，發(fā)酵液中菌體體型形態(tài)正常，極少數(shù)菌體仍處于出芽狀態(tài)，菌體最大濃度達(dá)到3.0×109個(gè)/mL，隨后菌體進(jìn)入平穩(wěn)期，菌體濃度不再大幅上升，發(fā)酵液中的rHSA達(dá)到最大值160 mg/L，但隨著時(shí)間的延續(xù)發(fā)酵液中的rHSA被不斷降解時(shí)發(fā)酵液中的rHSA含量降低。菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，發(fā)酵液中的殘?zhí)橇炕颈３植蛔兙S持在5 g/L附近。因此，在10 L機(jī)械式攪拌發(fā)酵罐水平上，菌體在30 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，發(fā)酵液中rHSA產(chǎn)量達(dá)到最高160 mg/L。

2.2.2 溶氧與重組人血清蛋白含量的關(guān)系

溶氧在發(fā)酵過程中不斷變化，其與rHSA含量的關(guān)系見圖3。

由圖3可知，當(dāng)菌體進(jìn)入對數(shù)生長期后，溶氧（dissolved oxygen，OD）值一直保持在一個(gè)較低的水平，低水平的溶氧值一直維持到了穩(wěn)定期的后期，當(dāng)rHSA被大量水解后，發(fā)酵液的DO值迅速上升，此時(shí)發(fā)酵液能聞到一股乙醇的味道，發(fā)酵液中的NCY-1菌體開始進(jìn)入無氧呼吸階段。因此當(dāng)發(fā)酵液中的DO值突然升高時(shí)可以作為結(jié)束發(fā)酵的一個(gè)考慮指標(biāo)。

圖3 DO和rHSA 的關(guān)系Fig.3 Relationship between DO and rHSA

2.2.3 補(bǔ)料對菌體濃度和rHSA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵后期由于碳源的不足導(dǎo)致菌體濃度不再增加，發(fā)酵液中的rHSA產(chǎn)量也不再上升，因此考慮到了通過后期補(bǔ)料的方法來刺激菌體的二次生長。補(bǔ)加葡萄糖及甘油對菌體濃度影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 補(bǔ)料對菌體濃度的影響Fig.4 Effect of feeding on the concentration of yeast

由圖4可知，后期（發(fā)酵時(shí)間30 h后）補(bǔ)加10 g/L葡萄糖或是10 g/L甘油都會(huì)刺激菌體的二次生長，但是葡萄糖促使菌體二次生長的效果明顯要高于甘油。補(bǔ)料后2 h分別對發(fā)酵液中的菌體濃度及rHSA產(chǎn)量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加了葡萄糖的發(fā)酵液中菌體濃度及rHSA的最高產(chǎn)量可分別達(dá)到4.95×109個(gè)/mL及185 mg/L，而補(bǔ)加了甘油的發(fā)酵液中菌體濃度及rHSA的最高產(chǎn)量可分別達(dá)到3.85×109個(gè)/mL及176 mg/L。NCY-1產(chǎn)rHSA的作用機(jī)理是將目的基因插入到甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADP）蛋白序列的前端，所以只要發(fā)酵液中的NCY-1表達(dá)3-磷酸甘油醛脫氫酶，發(fā)酵液中就應(yīng)該表達(dá)外源插入的rHSA基因。甘油是三碳化合物，在甘油激酶的催化下，磷酸化成3-磷酸甘油，然后經(jīng)氧化脫氫酶變成磷酸二羥丙酮再經(jīng)3-磷酸甘油醛脫氫酶進(jìn)入糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）。但是由于發(fā)酵液中的葡萄糖效應(yīng)以及發(fā)酵液中加入甘油后會(huì)形成甘油二酯和甘油三酯等物質(zhì)，所以促進(jìn)菌體生長及rHSA產(chǎn)生的效果不如葡萄糖，因此若想通過后期（發(fā)酵時(shí)間30 h后）補(bǔ)加的方式來增加rHSA的產(chǎn)量，優(yōu)先選擇流加10 g/L葡萄糖。

2.3 3 L搖瓶水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵液中蛋白酶的研究結(jié)果

在3 L搖瓶水平發(fā)酵結(jié)束后，分別取出20 mL發(fā)酵液，加入1.00 g rHSA，再取20 mL蒸餾水加入1.00 g rHSA作為空白組實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示。

表1 加熱處理對rHSA含量的影響Table 1 Effect of heat treatment on rHSA content

由表1可知，沒有加熱處理的發(fā)酵液，經(jīng)過30 ℃的保溫處理10 h后，加入的1.00 g牛血清白蛋白完全被水解，而經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵液盡管經(jīng)過30 ℃的保溫處理10 h后，其白蛋白濃度基本保持不變，這充分說明菌株NCY-1在合成白蛋白的過程中也能夠分泌一定量的胞外蛋白酶，導(dǎo)致發(fā)酵液中的rHSA被降解?？瞻自囼?yàn)說明新配的發(fā)酵液中沒有蛋白酶，所以蛋白酶的來源并非是原始發(fā)酵液而是在后期的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，所以要想提高發(fā)酵液中rHSA的產(chǎn)量需要在后期注意抑制蛋白酶的活力。

2.3.2 硫酸銨對發(fā)酵液中rHSA含量的影響

為探究發(fā)酵液中銨離子對rHSA含量的影響，在3 L搖瓶水平上進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)組中，始終維持發(fā)酵液中的（NH4）＋質(zhì)量濃度在3.0 g/L，而空白組不做任何處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 銨離子濃度對rHSA含量的影響Fig.5 Effect of NH4+concentration on rHSA content

由圖5可知，發(fā)酵時(shí)間＜46 h，空白組中的rHSA的含量略高于實(shí)驗(yàn)組，原因可能是在發(fā)酵前期，硫酸銨影響了發(fā)酵液中的pH值，使溶液pH值高于NCY-1的最適生長pH值，影響了菌體的正常生長，所以前期空白組中蛋白表達(dá)量較高。發(fā)酵時(shí)間＞46 h以后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，空白組蛋白的表達(dá)量明顯低于實(shí)驗(yàn)組，可能原因是，發(fā)酵液中存在的硫酸銨不僅抑制了蛋白酶的活性，還為NCY-1合成白蛋白提供了充足的銨離子，所以使得發(fā)酵液中的蛋白含量偏高，但是發(fā)酵時(shí)間＞56 h后，白蛋白的含量還是有所下降，可能原因是發(fā)酵液中的碳源不足，導(dǎo)致rHSA被分解。所以在后期實(shí)驗(yàn)可以考慮在菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長期約30 h時(shí)再補(bǔ)加硫酸銨，使流加后發(fā)酵液中的銨離子濃度始終維持在3.0 g/L。

3 結(jié)論

由于種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分相似，所以種子液一經(jīng)接種到10 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，菌體立刻入了對數(shù)生長期，30 h后菌體進(jìn)入平穩(wěn)期，菌體能達(dá)到的最大菌體濃度為3.0×109個(gè)/mL，最大rHSA產(chǎn)量為160 mg/L，30 h后在發(fā)酵罐中補(bǔ)加10 g/L葡萄糖后，最大產(chǎn)量可達(dá)到185 mg/L；而在3 L搖瓶基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)得出發(fā)酵液中確實(shí)存在較高活性的蛋白酶，但若始終保持發(fā)酵液中銨離子含量為3.0 g/L時(shí)，能有效的緩解發(fā)酵液中的rHSA的降解速度，提高發(fā)酵液中rHSA的產(chǎn)量。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以考慮將硫酸銨的作用放大到10 L發(fā)酵罐中，以期達(dá)到更好的效果。

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