尉 杰，黃小燕，陳慶富

（貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，生命科學(xué)學(xué)院 植物遺傳育種研究所，貴州 貴陽550001）

蕎麥（Buckwheat）屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）一年生或多年生雙子葉草本植物［1］，起源于我國西南地區(qū)。蕎麥?zhǔn)撬幨惩吹淖魑铮哂歇?dú)特的食療、保健作用，在降“三高”、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗衰老以及改善亞健康狀態(tài)等方面都有積極的作用，具有較高的開發(fā)價值。蕎麥中主要的活性物質(zhì)為黃酮類化合物，甜蕎種子的黃酮類化合物含量一般在0．02%～0．789%，苦蕎在1．08%～3．6%［2］。同時蕎麥種子中淀粉含量達(dá)60%以上［3］，是一種良好的釀酒原料。使用甜蕎麥經(jīng)液化發(fā)酵，可釀制出酒精度在10%～14%Vol的蕎麥酒［4］。

金蕎麥（Fagopyrum cymosum complex）為蕎麥屬（Fagopyrum Mill）植物［1］。金蕎麥葉和花中的黃酮類物質(zhì)較高，分別達(dá)5%和10%以上，野生金蕎麥中的生物類黃酮、氨基酸、維生素、微量元素等含量均高于苦蕎和甜蕎。金蕎茶由金蕎麥葉經(jīng)發(fā)酵加工而成，含有豐富的營養(yǎng)保健成分［5－6］，金蕎茶浸泡后的茶湯亦含有豐富的黃酮及可溶性蛋白。在蕎麥酒的釀制研究中發(fā)現(xiàn)，采用單一甜蕎麥作為原料，蕎麥酒中的營養(yǎng)成分有限，由于金蕎麥茶含有豐富的營養(yǎng)成分，在蕎麥酒的釀制中添加金蕎茶可豐富蕎麥酒中的營養(yǎng)成分，提高蕎麥酒的保健價值，對蕎麥酒品質(zhì)改善具有積極作用。

蕎麥酒發(fā)酵過程中，微生物只能分解利用其中的還原糖將其轉(zhuǎn)化為酒精，而糖化是將谷物中淀粉分解為微生物可利用的還原糖的過程。蕎麥樣品中還原糖含量為僅為0．56%［7］，還原糖含量較低，從而導(dǎo)致蕎麥酒的酒精度較低。在前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，金蕎茶粉經(jīng)過糖化后發(fā)酵所得發(fā)酵液酒精度在6%～7%，未經(jīng)糖化的試驗組發(fā)酵液酒精度在4%，表明金蕎茶粉在經(jīng)糖化后可發(fā)酵程度較高，為提高蕎麥酒的品質(zhì)，提高其酒精度，試驗采用混合后共同糖化的方式對添加金蕎茶的發(fā)芽甜蕎麥種子粉進(jìn)行糖化工藝的研究。

1 材料與方法

1．1 材料

豐甜1號甜蕎種子：貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物遺傳育種研究所蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供；金蕎茶：由貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物遺傳育種研究所蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心培育、栽培于貴陽市永樂鄉(xiāng)貴州師范大學(xué)柏楊實驗基地的金蕎麥“金蕎1號”經(jīng)發(fā)酵加工制得的金蕎麥葉發(fā)酵茶；糖化酶：北京索萊寶科技有限公司；安琪酵母釀酒曲：市售；檸檬酸、甲醇、3，5－二硝基水楊酸、NaOH、丙三醇、碘化鉀、HCl等均為分析純。

儀器與設(shè)備：LRH－800－G 型光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠），755B型紫外可見分光光度計（上海金鵬有限公司），WGL－45（B）型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司），pHS－3C 型pH 酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司），AR1140 型電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）。

1．2 原料制備

使用粉碎機(jī)將金蕎麥葉發(fā)酵茶打粉，粉末直徑約0．5～0．8mm，將豐甜1號蕎麥種子發(fā)芽3～5d，待芽長約0．5cm 時烘干打粉備用。

1．3 金蕎茶粉添加量的確定

由于金蕎茶粉由金蕎葉制成，淀粉含量較低。試驗發(fā)現(xiàn)純金蕎麥葉發(fā)酵茶粉經(jīng)糖化發(fā)酵后酒精度在6%左右，過量添加金蕎茶粉將會影響酒液酒精度，同時為了兼顧材料成本，以所釀原酒酒精度作為限制金蕎茶粉添加的主要指標(biāo)。分別以10%、15%、20%、25%、35%的蕎麥茶粉添加量進(jìn)行發(fā)酵試驗，以1∶4的料水比添加6%的安琪酵母釀酒曲在30℃下發(fā)酵8d，重復(fù)2次

1．4 糖化

將金蕎麥葉發(fā)酵茶粉與蕎麥發(fā)芽種子粉按一定比例混勻后加熱蒸熟，調(diào)節(jié)溫度、pH、添加糖化酶進(jìn)行糖化。

1．4．1 各影響因素的考察

1）糖化溫度。溫度主要通過影響糖化酶的活性來影響還原糖含量，根據(jù)糖化酶最適溫度設(shè)計糖化溫度分別為55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，使用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 為4，糖化酶添加量6%，糖化時間為70min，重復(fù)2次，下同。

2）pH 。pH 通過影響糖化酶的活性來影響還原糖含量，根據(jù)糖化酶最適pH 設(shè)計糖化pH 分別為3．5、4、4．5、5、5．5、6，溫度為60℃，酶添加量為6%，糖化時間為70min。

3）糖化酶添加量。酶添加量過少將不能滿足催化反應(yīng)的需要，過多會促使復(fù)合反應(yīng)的發(fā)生使還原糖含量下降。根據(jù)已報道的類似試驗，設(shè)計酶添加量分別為3．5%、4%、4．5%、5%、5．5%、6%，pH 為4，溫度為60℃，糖化時間70min。

4）糖化時間。糖化時間過短則糖化反應(yīng)不充分，還原糖含量過低；糖化時間過長，則糖化酶失去活性，還原糖含量不再增加。設(shè)計糖化時間分別為30min、40min、50min、60min、70min、80min，pH4，酶添加量為6%，溫度為60℃。

1．4．2 響應(yīng)面設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定糖化溫度、糖化pH、酶添加量作為響應(yīng)面試驗設(shè)計中的三個因素，糖化時間統(tǒng)一定為70min。根據(jù)單因素試驗結(jié)果采用Design－Expert 8．0．6軟件設(shè)計Box－behnken響應(yīng)面試驗，其因素水平見表1。

表1 發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉的糖化試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of saccharification experiment of buckwheat seed powder with golden buckwheat leaf fermented tea

1．5 理化指標(biāo)的測定

酒精度計法測定酒精含量、DNS法測定還原糖含量［8］。

1．6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用紫外分光光度計法測定糖化液中還原糖含量（以葡萄糖計），制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取7 支25mL具塞刻度試管編號，按表2分別加入濃度為1mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3，5－二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進(jìn)行比色。調(diào)波長520nm，用0號管調(diào)零點，測出1～6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0．985 8x＋0．014 6，R2＝0．9975。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 2 The dosage of reagent when making glucose standard curve

2 結(jié)果與分析

2．1 不同金蕎粉添加量的酒精度

由于試驗所用金蕎茶由金蕎麥葉制成，因此其淀粉含量要遠(yuǎn)低于蕎麥粉，添加金蕎茶粉后勢必會對發(fā)酵所得酒液酒精度有一定程度的影響。由圖1可見，隨著金蕎茶粉添加量的提高，發(fā)酵所得酒液酒精度不斷下降，且酒液經(jīng)后期處理酒精含量會有一定損失，為保證成品酒液酒精含量，以及緩沖操作工藝對最終釀得酒液酒精含量的影響，采用20%的金蕎茶粉添加量進(jìn)行糖化試驗。

圖1 不同金蕎茶粉添加量的酒精度變化Fig．1 Variation alcohol degree with different adding amount of golden buckwheat tea powder

2．2 不同因素對發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉還原糖含量的影響

由圖2可看出，隨著糖化溫度的提高，還原糖含量先上升后下降，在65℃左右達(dá)最高值。隨著糖化pH 的提高，還原糖含量同樣先上升后下降，在pH4．5左右時達(dá)最高值。隨著糖化酶添加量的增加，還原糖含量先上升然后趨于平穩(wěn)，并有小幅下降，在糖化酶添加量約4．5%時達(dá)最高值。隨著糖化時間的延長，還原糖含量不斷上升，在60 min后再延長糖化時間還原糖含量幾乎保持穩(wěn)定。

圖2 不同糖化溫度、pH、酶添加量、時間的發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉還原糖含量Fig．2 Content of reducing sugar of different saccharification temperature，pH，enzyme dosage，time ofgermination buckwheat seed powder mixed with golden buckwheat tea powder

2．3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉的糖化工藝

采用Design－Expert 8．0．6軟件對不同處理發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉的還原糖含量（表3）進(jìn)行分析，通過多元回歸擬合分析，得到以還原糖含量為因變量，糖化溫度、糖化pH、糖化酶添加量自變量的回歸方程模型為：y＝24．62＋1．53 x1＋1．15x2＋0．55 x3－0．13 x1x2－0．28 x1x3－0．17 x2x3－5．77 x12－2．17 x22－1．52 x32，對該模型進(jìn)行方差分析可知，該模型P＜0．000 1極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義，失擬值P＝0．894 1＞0．1，說明方程具有較好的擬合程度，分析結(jié)果可靠。模型一次項x1、x2、x3，P 值均小于0．001 其顯著性為極顯著，交互項x1x2、x1x3、x2x3的P 值分別為0．049 7、0．001 2、0．012 8，達(dá)顯著水平，二次項x12、x22、x32P 值均小于0．000 1，達(dá)極顯著水平。x1、x2、x3的F 值分別為1 669．679、949．487、217．180，因此各因素對還原糖含量影響的大小為糖化溫度＞糖化pH＞糖化酶添加量。

2．4 各因素間的交互作用

為直觀分析各因素對糖化所得還原糖含量的影響，根據(jù)所得回歸方程建立等高線圖及響應(yīng)曲面圖。圖3～5 依次為酶添加量6%、糖化pH 5、糖化溫度60℃的因素間交互作用的響應(yīng)面與等高線圖。

表3 不同處理發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉的還原糖含量Table 3 Content of reducing sugar of different saccharification conditions germination buckwheat seed powder mixed with golden buckwheat leaves fermented tea powder

由圖3～5可知，等高線圖中最高值等高線均接近閉合或閉合，最佳糖化工藝在試驗設(shè)計范圍內(nèi)。響應(yīng)面圖及其等高線顯示，還原糖獲得量隨各兩因素的增加呈先上升趨勢隨后略有下降。等高線的形狀為橢圓形時表示交互作用強(qiáng)為圓形時表示交互作用弱。圖3～5顯示，各因素之間均有交互作用，糖化溫度與pH 之間的交互作用與糖化溫度與酶添加量之間的交互作用均較強(qiáng)，糖化pH 與酶添加量的交互作用稍弱。

圖3 糖化時間與pH 對還原糖含量影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig．3 The response surface and contour map of the effect of saccharification time and pH on the content of reducing sugar

圖4 糖化溫度與酶添加量對還原糖含量影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig．4 The response surface and the contour map of the effect of saccharification temperature and adding amount of enzyme on the content of reducing sugar

圖5 糖化pH 與酶添加量的對還原糖含量影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig．5 The response surface and the contour map of the effect of saccharification pH and adding amount of enzyme on the content of reducing sugar

2．5 最佳工藝條件的確定及驗證

使用Design－Expert 8．0．6軟件對所得回歸方程進(jìn)行分析，獲得最佳糖化工藝為糖化溫度65．63℃，糖化pH 4．63，糖化酶添加量5．15%，還原糖最高含量理論預(yù)測值為24．904 9%。根據(jù)此最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，由于儀器設(shè)備精度以及操作問題可能無法準(zhǔn)確按照最佳理論工藝進(jìn)行試驗，設(shè)置糖化溫度位65．6℃，糖化pH 為4．6，糖化酶添加量為5．15%，進(jìn)行3 次平行試驗，還原糖平均含量為24．83%，與理論預(yù)測值較為接近。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)試驗得出，發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉的最佳糖化工藝為糖化溫度65．63℃，糖化pH4．63，糖化酶添加量5．15%，還原糖最高含量理論預(yù)測值為24．9049%。對此條件進(jìn)行驗證，由于儀器精度的緣故，設(shè)置糖化溫度位65．6℃，糖化pH 為4．6，糖化酶添加量為5．15%，還原糖平均含量為24．83%。

彭 海 文［7］、陳 楠［9］、裴 劍 飛［10］等 均 通 過 正 交 試驗對蕎麥種子粉糖化工藝進(jìn)行研究。本研究首次對發(fā)芽甜蕎種子粉混合金蕎茶粉進(jìn)行糖化工藝研究，并通過Box－behnken試驗建立數(shù)學(xué)模型對甜蕎麥糖化過程進(jìn)行模擬。彭海文研究中還原糖含量約在30%左右，比試驗高出約5%，原因可能是本研究所用材料為發(fā)芽甜蕎粉，發(fā)芽過程會減少淀粉含量，且試驗中添加了淀粉含量較低的金蕎麥酵茶粉，由此導(dǎo)致糖化之后醪液中還原糖含量有所降低。本文所得最佳工藝中酶添加量為5．15%，與陳楠的研究相比酶添加量較少（最適酶添加量6%），其原因為本試驗采用原料淀粉含量低于甜蕎麥直接打粉為原料的淀粉含量，5．15%酶添加量即可滿足本試驗需要。同時，彭海文試驗中糖化時間為40 min，而通過單因素試驗可看出，本試驗40min并未達(dá)到還原糖含量的最高值，故本試驗將糖化時間延長到70 min，也在一定程度上提高了還原糖的含量。本研究還發(fā)現(xiàn)各因素對還原糖含量影響的大小為糖化溫度＞糖化pH＞糖化酶添加量。所得甜蕎麥發(fā)芽種子粉在添加金蕎麥葉發(fā)酵茶后的糖化過程最佳工藝對發(fā)酵工藝研究有一定的指導(dǎo)意義。

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