馬細(xì)蘭 張 勇 陳勇智 周立斌

(1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系 生物技術(shù)研究所 惠州 516007;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510275)

脊椎動(dòng)物的繁殖和生長活動(dòng)不但密切聯(lián)系而且相互作用,生長激素受體(Growth hormone receptor,GHR)基因的mRNA表達(dá)在動(dòng)物性腺中可普遍檢測(cè)到,雌激素應(yīng)答元件在哺乳動(dòng)物GHR基因的5’調(diào)控區(qū)也有發(fā)現(xiàn)(Goodyer et al,2001)。性類固醇激素調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物生長軸相關(guān)基因的表達(dá)存在一定物種的差異性。用雌二醇(17β-estradiol,E2)處理可降低兔肝臟 GHR mRNA 水平(Domené et al,1994),但提高大鼠肝臟GHR mRNA水平(Gabrielsson et al,1995)。雄激素對(duì)GHR的表達(dá)同樣有影響,向垂體切除大鼠注射睪酮(Testosterone,T)可誘導(dǎo)其肝臟GHR mRNA水平上升(Zung et al,1999),說明T會(huì)促進(jìn)生長激素GH介導(dǎo)的生理作用。雄激素和雌激素在調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長時(shí)可能起不同的作用,雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)促進(jìn)生長,與此相反,E2抑制生長(Borski et al,1996)。

許多動(dòng)物的雌雄個(gè)體存在較大差異,雌雄生長速度也存在差異,并且這種差異在動(dòng)物性腺發(fā)育成熟時(shí)更為明顯,這可能與性類固醇激素的不同分泌水平有關(guān)(Mandiki et al,2004,2005)。哺乳動(dòng)物生長的性別二態(tài)性通過血液循環(huán)中的性類固醇激素、GH和IGF-I的相互作用來調(diào)節(jié)(Wehrenberg et al,1992)。許多魚類有明顯的生長性別二態(tài)性,尼羅羅非魚是其中一種。尼羅羅非魚雄魚比雌魚的生長明顯要快,而且這種生長差異在性腺成熟時(shí)更加顯著。

性類固醇激素對(duì)動(dòng)物的生長有一定的影響,但其對(duì)魚類雌雄生長差異的影響機(jī)理尚不清楚。為了進(jìn)一步了解動(dòng)物雌雄生長差異的內(nèi)在原因,作者通過在體注射實(shí)驗(yàn),比較了兩種性類固醇激素(E2、MT)對(duì)雌、雄尼羅羅非魚生長及生長軸相關(guān)基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

尼羅羅非魚采自廣東省番禺國家級(jí)羅非魚良種場(chǎng),參照文獻(xiàn)(馬細(xì)蘭等,2010),設(shè)計(jì)了長期注射和短期注射兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室自配魚用生理鹽水(PS);雌二醇(17β-estradiol,E2)和甲基睪酮(17α-methyltestosterone,MT)均為美國Sigma公司產(chǎn)品(Sigma,America),溶于花生油后注射,濃度均為50μg/g體重。對(duì)于長期注射實(shí)驗(yàn),分別在注射后第 0、2、6、10周采樣,測(cè)體長、體重、肝重等,檢測(cè)性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚生長性能的影響;對(duì)于短期注射實(shí)驗(yàn),則在注射后第 6、12、24h采樣,采用Real-time PCR檢測(cè)性類固醇激素E2、MT對(duì)生長軸基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)mRNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備參照文獻(xiàn)(馬細(xì)蘭等,2010)。

1.2 方法

1.2.1 生長性能分析 選用以下幾種參數(shù),計(jì)算公式如下:

1.2.2 生長軸相關(guān)基因表達(dá)分析 采用 Real-time PCR檢測(cè)性類固醇激素(E2、MT)對(duì)垂體 GH、肝臟GHR、肝臟IGF-I mRNA表達(dá)的影響,各基因特異性引物參見表1。Real-time PCR方法參照文獻(xiàn)(馬細(xì)蘭等,2010),略有修改。

2 結(jié)果

2.1 長期注射E2、MT對(duì)生長的影響

雄魚在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的體重均大于雌魚。從注射后42天起,E2明顯促進(jìn)雌魚的生長(P＜0.05),但不影響雄魚的生長(P＞0.05);MT明顯增加雄魚體重(P＜0.05),但對(duì)雌魚體重?zé)o顯著影響(P＞0.05)(圖1)。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析所用引物Tab.1 Primers for real-time PCR

圖1 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚體重的影響(a.雌魚,b.雄魚)Fig.1 Effects of steroid hormones on body weights of female(a)and male (b)Nile tilapia

性類固醇激素E2、MT既影響了尼羅羅非魚體重,同時(shí)還影響了尼羅羅非魚其它各項(xiàng)生長參數(shù)。由表2可以看出,性類固醇激素E2、MT對(duì)尼羅羅非魚生長的影響存在明顯的性別二態(tài)性。不同組魚的肥滿度(K)沒有顯著差異(P＞0.05),性類固醇激素不影響尼羅羅非魚的K(P＞0.05);所有組中雌魚的性成熟度(GSI)都顯著高于雄魚(P＜0.05),但性類固醇激素對(duì) GSI無顯著影響(P＞0.05);MT組雄魚的肝體系數(shù)(HSI)顯著高于其它組(P＜0.05),MT顯著提高雄魚的HSI而不影響雌魚的HSI,E2明顯提高雌魚的HSI(P＜0.05),但對(duì)雄魚的HSI無影響(P＞0.05);E2顯著提高雌魚的絕對(duì)生長率(AGRW),提高了 24.16%,但不影響雄魚的AGRW,MT顯著提高雄魚和雌魚的 AGRW分別提高了 14.09%和 11.20%(表 2)。

表2 生長參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=20)Tab.2 Growth parameters (mean values±S.D.,n=20)

2.2 長期注射E2、MT對(duì)生長軸相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 垂體 GH mRNA 長期注射 E2可使雌魚垂體GH mRNA水平明顯升高(P＜0.05),但對(duì)雄魚垂體GH mRNA 的表達(dá)無顯著影響(P＞0.05);長期注射MT可顯著提高雄魚垂體 GH mRNA水平(P＜0.05),但不影響雌魚垂體GH mRNA的表達(dá)(圖2)。

圖2 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚垂體GH mRNA水平的影響Fig.2 Real-time PCR analysis on pituitary GH mRNA levels in Nile tilapia

2.2.2 肝臟 GHR1 mRNA 長期注射E2可促進(jìn)雌魚(P＜0.05),但不影響雄魚肝臟GHR1 mRNA的表達(dá);長期注射MT,雄魚肝臟GHR1 mRNA的表達(dá)有顯著提高(P＜0.05),對(duì)雌魚無影響(圖3)。

圖3 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟GHR1 mRNA水平的影響Fig.3 Real-time PCR analysis on liver GHR mRNA levels in Nile tilapia

2.2.3 肝臟 IGF-I mRNA 長期注射 E2同時(shí)提高雌魚和雄魚肝臟IGF-I mRNA表達(dá)水平(P＜0.05);長期注射MT,雄魚肝臟IGF-I的mRNA表達(dá)顯著提高(P＜0.05),但對(duì)雌魚無明顯影響。E2對(duì)雌魚肝臟IGF-I表達(dá)的促進(jìn)作用低于 MT對(duì)雄魚的促進(jìn)作用(P＜0.05)(圖4)。

2.3 短期注射E2、MT對(duì)生長軸相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 垂體 GH mRNA 短期注射性類固醇激素E2、MT,對(duì)尼羅羅非魚垂體GH mRNA表達(dá)的作用顯示出明顯的性別二態(tài)性。注射E26h后,可快速、明顯提高雌魚垂體GH mRNA的表達(dá),但顯著降低雄魚的表達(dá)(P＜0.05);相反,注射MT 12h后,可明顯提高雄魚垂體GH mRNA的表達(dá),但顯著降低雌魚的表達(dá)(P＜0.05)(圖5)。

圖4 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA水平的影響Fig.4 Real-time PCR analysis on liver IGF-I mRNA levels in Nile tilapia

2.3.2 肝臟 GHR1 mRNA 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟 GHR1 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)也存在性別二態(tài)性。E2作用12h后明顯促進(jìn)雌魚肝臟GHR1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05),24h后小幅度下調(diào)雄魚的表達(dá)(P＜0.05);MT作用 12h后可明顯提高雄魚肝 GHR1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05),24h后可進(jìn)一步提高雄魚肝臟 GHR1的表達(dá),24h后還可小幅度上調(diào)雌魚肝臟GHR1 的表達(dá)(P＜0.05)(圖6)。

2.3.3 肝臟 IGF-I mRNA 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)同樣存在雌雄差異性。注射E224h后,雌魚肝臟IGF-I mRNA的表達(dá)明顯升高,但雄魚的表達(dá)受到抑制(P＜0.05);MT作用 24h后顯著提高雄魚肝臟 IGF-I mRNA的表達(dá)(P＜0.05),而對(duì)雌魚肝臟IGF-I的mRNA表達(dá)則無顯著影響(圖7)。

3 討論

對(duì)性類固醇激素調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生長的研究較多,對(duì)魚類的研究較少。本文報(bào)道了性類固醇激素 E2、MT調(diào)節(jié)尼羅羅非魚生長的性別二態(tài)性,即 E2、MT對(duì)尼羅羅非魚雌、雄魚的生長均有調(diào)節(jié)作用,并且這種調(diào)節(jié)作用存在明顯的雌雄差異性。雄激素MT不但促進(jìn)雄魚還促進(jìn)雌魚的生長,并提高生長軸相關(guān)基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)的mRNA表達(dá)水平;雌激素E2則僅促進(jìn)雌魚的生長和提高雌魚垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I的表達(dá)水平,對(duì)雄魚的生長和生長軸相關(guān)基因的表達(dá)卻有下調(diào)趨勢(shì)。

圖5 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚垂體GH mRNA水平的影響Fig.5 Real-time PCR analysis on pituitary GH mRNA levels in Nile tilapia

尼羅羅非魚雌魚的性成熟度(GSI)顯著高于雄魚,提示雌魚分配了更多的能量在生殖上,從而減少了在生長上的能量分配,這也是雌魚生長比雄魚慢的一個(gè)原因。

一方面,性類固醇激素可能通過影響魚類的攝食、消化來影響生長,另一方面,也可能通過影響生長軸的激素水平、受體濃度、結(jié)合蛋白水平等來調(diào)節(jié)生長(Mandiki et al,2004,2005;Meinhardt et al,2006)。 對(duì)哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類中雄性個(gè)體較雌性個(gè)體大的物種進(jìn)行研究,結(jié)果表明雄激素同時(shí)也是一種代謝激素,可以促進(jìn)動(dòng)物的肌肉和骨骼生長。但十分有趣的是,雄激素不但不促進(jìn)反而會(huì)抑制某些雌性個(gè)體較大的爬行類動(dòng)物的生長(Cox et al,2005)。甲基睪酮(MT)可顯著增加尼羅羅非魚的攝食,并提其高生長速率,血清中 T的濃度雄魚高于雌魚,從而使雄魚的生長速度顯著高于雌魚(Riley et al,2002)。在本研究中,甲基睪酮(MT)明顯促進(jìn)尼羅羅非魚雄魚的生長,原因可能包括以下幾點(diǎn): (1)MT可能增加了雄魚的攝食,從而促進(jìn)其生長;(2)MT可能提高了雄魚肝臟GHR對(duì)GH的敏感性;(3)MT對(duì)雄魚生長軸相關(guān)基因的mRNA表達(dá)均有促進(jìn)作用,使雄魚血清中的GH或IGF-I水平提高,從而加快雄魚的生長。

圖6 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟GHR1 mRNA水平的影響Fig.6 Real-time PCR analysis on liver GHR mRNA levels in Nile tilapia

雄激素對(duì)哺乳動(dòng)物生長激素受體GHR的影響表現(xiàn)出種間特異性。給兔注射睪酮T,可提高肝臟GHR mRNA的水平(Yu et al,1996),但不影響大鼠肝臟GHR mRNA水平(Gabrielsson et al,1995)。迄今,有關(guān)雄激素對(duì)硬骨魚類GHR調(diào)節(jié)的研究報(bào)道不多。南方鲇在體注射MT后,肝臟GHR mRNA水平的顯著升高(章力等,2006)。在本文中,給尼羅羅非魚長期注射MT,可顯著提高雄魚肝臟GHR mRNA的水平,但對(duì)雌魚沒有顯著影響,MT對(duì)尼羅羅非魚肝臟 GHR mRNA的調(diào)節(jié)作用存在明顯的性別差異性。

圖7 性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA水平的影響Fig.7 Real-time PCR analysis on liver IGF-I mRNA levels in Nile tilapia

給尼羅羅非魚注射雄激素 MT,雄魚肝臟 IGF-I mRNA的表達(dá)有顯著提高,該結(jié)果與前人研究報(bào)道一致。注射T、11-KT后,不影響銀大麻哈魚血清中GH水平,但顯著提高血清中IGF-I、IGFBP-3的水平,提示血清中IGF-I水平的變化是性類固醇激素直接作用的結(jié)果,而非通過 GH來實(shí)現(xiàn);亦或是通過提高肝臟對(duì)GH的敏感性來實(shí)現(xiàn),也可能是因?yàn)樘岣吡搜逯蠭GFBP-3的水平(Larsen et al,2004)。

E2可提高性未成熟金魚和虹鱒血清GH水平,一方面,E2可能通過影響下丘腦生長激素釋放抑制因子(Somatotropin Release Inhibiting Factor,SRIF)及其受體來調(diào)節(jié)垂體GH的釋放;另一方面,E2可能通過增大垂體中 GH細(xì)胞對(duì)下丘腦生長激素釋放激素(Growth Hormone Releasing Hormone,GHRH)的敏感性來促進(jìn)垂體 GH的分泌,使血清中 GH水平上升(Holloway et al,1997;Zou et al,1997)。切除成熟雌鼠的卵巢(去除了內(nèi)源性 E2),鼠血清中 IGF-I的水平會(huì)上升,這時(shí),若加入外源的 E2則會(huì)使血清中的 IGF-I水平降低,并且會(huì)抑制肝細(xì)胞的 IGF-I mRNA表達(dá),使生長變慢(Borski et al,1996)。去勢(shì)雄兔和性未成熟南方鲇經(jīng)E2處理后,肝臟GHR mRNA水平都顯著下降(Yu et al,1996;章力等,2006)。在本次研究中,尼羅羅非魚注射雌激素 E2可明顯提高雌魚垂體 GH mRNA的水平,促進(jìn)了垂體GH的合成。E2還促進(jìn)尼羅羅非魚雌魚肝臟GHR1和IGF-I mRNA的表達(dá),使生長軸上調(diào),生長速度加快;相反,E2顯著抵制雄魚的生長和生長軸相關(guān)基因的表達(dá),一方面,可能是E2能使雄魚垂體的GH分泌模式雌性化,進(jìn)而使其生長模式也雌性化,生長速度變慢;另一方面,可能是 E2顯著降低了雄魚肝臟GH和GHR mRNA的水平,使生長軸下調(diào),生長速度變慢。

性類固醇激素對(duì)尼羅羅非魚的生長及生長軸相關(guān)基因的表達(dá)有一定的影響作用,并且這種作用表現(xiàn)出明顯的雌雄差異性,提示雄魚和雌魚體內(nèi)的性類固醇激素水平不同有可能是引起雌魚和雄魚生長差異顯著、個(gè)體差異明顯的另一內(nèi)在原因。

馬細(xì)蘭,張 勇,劉曉春等,2010.半胱胺鹽酸鹽(CSH)對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長及生長軸相關(guān)基因表達(dá)的影響.海洋與湖沼,41(2): 240—245

章 力,黃希貴,焦保衛(wèi)等,2006.南方鲇兩種生長激素受體的結(jié)構(gòu)分析及其組織分布和激素調(diào)節(jié).動(dòng)物學(xué)報(bào),52(6):1096—1106

Borski R J,Tsai W,DeMott-Friberg R et al,1996.Regulation of somatic growth and the somatotropic axis by gonadal steroids: primary effect on insulin-like growth factor I gene expression and secretion.Endocrinology,137(8): 3253—3259

Cox R M,John-Alder H B,2005.Testosterone has opposite effects on male growth in lizards (Sceloporus spp.)with opposite patterns of sexual size dimorphism.J Exp Biol,208:4679—4687

Domené H M,Marin G,Sztein J et al,1994.Estradiol inhibits growth hormone receptor gene expression in rabbit liver.Mol Cellul Endocrinol,103(1—2): 81—87

Gabrielsson B G,Carmignac D F,Flavell D M et al,1995.Steroid regulation of growth hormone (GH)receptor and GH-binding protein messenger ribonucleic acids in the rat.Endocrinology,136(1): 209—217

Goodyer C G,Zogopoulos G,Schwartzbauer G et al,2001.Organization and evolution of the human growth hormone receptor gene 5’-flanking region.Endocrinology,142(5):1923—1934

Holloway A C,Leatherland J F,1997.Effect of gonadal steroid hormones on plasma growth hormone concentrations in sexually immature rainbow trout,Oncorhynchus mykiss.Gen Comp Endocrinol,105(2): 246—254

Larsen D A,Shimizu M,Cooper K A et al,2004.Androgen effects on plasma GH,IGF-I,and 41-kDa IGFBP in coho salmon (Oncorhynchus kisutch).Gen Comp Endocrinol,139(1): 29—37

Mandiki S N M,Babiak I,Bopopi J M et al,2005.Effects of sex steroids and their inhibitors on endocrine parameters and gender growth differences in Eurasian perch (Perca fluviatilis)juveniles.Steroids,70(2): 85—94

Mandiki S N M,Houbart M,Babiak I et al,2004.Are sex steroids involved in the sexual growth Dimorphism in Eurasian perch juveniles?.Physiol Behav,80(5): 603—609

Meinhardt U J,Ho Ken K Y,2006.Modulation of growth hormone action by sex steroids.Clin Endocrinol,65(4): 413—422

Riley L G,Richman III N H,Hirano T et al,2002.Activation of the growth hormone/insulin-like growth factor axis by treatment with 17 α-methyltestosterone and seawater rearing in the tilapia,Oreochromis mossambicus.Gen Comp Endocrinol,127(3): 285—292

Wehrenberg W B,Giustina A,1992.Basic counterpoint:mechanisms and pathways of gonadal steroid modulation of growth hormone secretion.Endocr Rev,13(2): 299—308

Yu Y M,Domené H M,Stzein J et al,1996.Developmental changes and differential regulation by testosterone and estradiol of growth hormone receptor expression in the rabbit.Eur J Endocrinol,135(5): 583—590

Zou J J,Trudeau V L,Cui Z et al,1997.Estradiol stimulates growth hormone production in female goldfish.Gen Comp Endocrinol,106(1): 102—112

Zung A,Phillip M,Chalew S A et al,1999.Testosterone effect on growth and growth mediators of the GH-IGF-I axis in the liver and epiphyseal growth plate of juvenile rats.J Mol Endocrinol,23(2): 209—221