谷偉，徐革鋒，戶國，黃天晴，張玉勇，白慶利，王炳謙

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

虹鱒Oncorhynchus mykiss是聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織優(yōu)先推薦的世界性養(yǎng)殖魚類。虹鱒全雌三倍體是不育品種，肉品質(zhì)高、養(yǎng)殖周期長，是鮭鱒魚產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)品種，我國年需卵量約3 000萬粒[1]。偽雄魚制備是虹鱒全雌三倍體規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一。虹鱒雌魚染色體型為XX，雄魚為XY型。因此，只要使雌性配子（XX）與含有X染色體的精子（XX）受精，就能大量獲得雌性后代，再通過靜水壓或水溫控制即可獲得全雌三倍體[2]?；诖四康?，通過雌核發(fā)育技術(shù)獲得全雌二倍體稚魚，在魚苗開始攝取外源性營養(yǎng)階段通過給予雄性激素誘導(dǎo)獲得性轉(zhuǎn)換雄魚（XX）。17ɑ-甲睪酮應(yīng)用最為廣泛，需控制好劑量，超量可致激素閹割[3,4]，目前已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[5-7]。

性類固醇激素的分泌水平與生長、配子發(fā)生和性腺成熟有關(guān)[8-11]，測定血清性類固醇激素可了解魚類性腺發(fā)育水平，對生產(chǎn)安排有指導(dǎo)作用。硬骨魚類的生殖過程受性類固醇激素睪酮（T）、11-酮基睪酮（11-KT）和雌二醇（E2）的調(diào)節(jié)，繁殖季節(jié)雌魚T和E2、雄魚T和11-KT隨著配子形成而逐漸增加，性腺成熟之后顯著下降[12]。E2在正常雄魚的繁殖中必不可少[13]。目前，已研究了虹鱒、斜帶石斑魚Epinephelus coioides、西伯利亞鱘Acipenser baeri等多種魚類性激素水平的年變化規(guī)律[14-16]，而虹鱒偽雄魚尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。

偽雄魚培育周期長，輸精管畸形，需要解剖魚獲取精巢使用。盲目剖魚取精觀察成熟度會導(dǎo)致培育成本大幅增加，造成浪費(fèi)。本研究按季節(jié)測定了虹鱒偽雄魚親本血清類固醇激素水平，掌握性激素變化狀況，以期為了解偽雄魚生殖狀態(tài)和合理安排生產(chǎn)提供基礎(chǔ)技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

所選取樣本為2013年3月和2014年3月通過17ɑ-甲睪酮（sigma公司）混合飼料投喂誘導(dǎo)的2批偽雄魚（三、四齡魚平均體質(zhì)量為2 200 g和3 056 g），以同時期培育的正常二倍體群體為對照（三、四齡平均體質(zhì)量為2 510g和3 600g），經(jīng)過3年培育為親本。親魚同池飼育，投喂鮭鱒親魚專用飼料（蛋白質(zhì)42%，脂肪22%），日投喂量為體質(zhì)量的1%～2%，日投喂2次。

1.2 組織切片

本研究選取3齡對照組與偽雄魚，每組10尾。性腺樣品采用Bouin’s液固定，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。通過KD1508型切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5 000～7 000nm，經(jīng)H.E染色，中性樹膠封片，用自動數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)拍照。

1.3 血清采集及性類固醇激素的測定

每2月采集一次血樣，每次采集正常雌、雄魚、偽雄魚各10尾，每尾魚血樣單獨(dú)進(jìn)行測定。采樣方法：樣本魚放入0.5 mL/L苯氧乙醇水溶液中麻醉2 min，尾靜脈采血，每尾取血量不少于5 mL。血樣在4℃冰箱中靜置2h，然后3 000 r/min離心10 min，分離出血清注入采樣管中，標(biāo)明日期及性別（均有個體識別標(biāo)記）。測試前血清保存在超低溫冰箱中，全部樣品集中測定性類固醇激素含量。采用DFM-96型16管放射免疫計數(shù)器測定血清中的雌二醇（E2）、睪酮（T）濃度，雙管平行測定。碘[125I]睪酮放射免疫分析藥盒和碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，經(jīng)SAS軟件進(jìn)行方差分析。用DUNCAN對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，比較結(jié)果用字母標(biāo)記法，在同一系列中相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同字母表示差異顯著（P＜0.05），相間字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 偽雄魚與正常二倍體雌雄魚解剖學(xué)和組織學(xué)觀察

解剖觀察發(fā)現(xiàn)，對照組魚精巢呈長條形，性腺飽滿，為白色，血管豐富，輸精管粗壯，精液可順利排出。偽雄魚精巢呈鵝卵石形，性腺飽滿，為白色，血管豐富，輸精管細(xì)狹并有結(jié)節(jié)，精液無法排出。圖1為偽雄魚與對照組魚的性腺解剖學(xué)與組織學(xué)觀察結(jié)果。從圖1中可以看出，對照組魚的精巢為一對，呈對稱分布。偽雄魚精巢兩側(cè)不對稱，其中一側(cè)或多或少地缺失一部分。比較發(fā)現(xiàn)，偽雄魚精巢與對照組魚精巢組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)并未有明顯差異，且偽雄魚的形態(tài)與卵巢相似。

2.2 三齡偽雄魚與正常二倍體雌雄魚血清中E2和T水平的比較

由圖2可知，三齡偽雄魚與對照組魚T含量均在 12月份達(dá)到最高，偽雄（7.222±2.889）ng/mL，雄魚 （13.944±3.709）ng/mL，雌魚 （3.610±3.096）ng/mL，雄魚T含量除6月份與雌魚無顯著差異外，其余月份均顯著高于雌性親本（P＜0.05）。偽雄魚T含量4月份降到最低（0.088±0.015）ng/mL，隨后逐漸升高；雄魚和雌魚T含量8月份降到最低，分別為（0.508±0.297）ng/mL和（0.274±0.027）ng/mL。圖3為三齡偽雄魚與對照魚E2含量的周年變化。由圖3可知，對照組雌魚E2含量除12月份與偽雄魚無顯著差異外，其余一年中都顯著高于雄魚和偽雄魚（P＜0.05）；對照組雄魚和雌魚E2含量10月到最高，分別為（82.658±5.777）pg/mL和（969.390±22.561）pg/mL，偽雄魚E2含量則在12月份最高（185.735±29.978）pg/mL。

2.3 四齡偽雄魚與正常二倍體雌雄魚血清中E2和T水平的比較

由圖4可知，四齡對照組雄魚和雌魚T含量均在12月份最高，分別為（12.080±5.834）ng/mL和（2.668±0.763）ng/mL，而偽雄魚T含量則在翌年2月最高（6.109±2.153）ng/mL，8月最低（0.548±0.309）ng/mL，隨后逐漸升高；雄魚和雌魚T含量分別在4月和2月降到最低，分別為（0.244±0.103）ng/mL和（0.051±0.008）ng/mL。圖5為四齡偽雄魚與對照組E2含量的周年變化。結(jié)果顯示，對照組雌魚E2含量除12月和2月份外，一年中都顯著高于雄魚和偽雄魚；對照組雌魚E2含量8月最高（1 068.867±64.561）pg/mL，對照組雄魚E2含量10月最高（85.139±37.123）pg/mL，偽雄魚含量 E2含量則在 12月最高（326.118±13.620）pg/mL，與雌魚無顯著差異，卻顯著高于雄魚（P＜0.05）。

圖1 偽雄魚與發(fā)育正常二倍體雌雄魚的性腺比較Fig.1 The gonadal morphology of male-induced and normal diploid male and female rainbow trout

圖2 三齡偽雄魚與對照組T周年變化Fig.2 The annual changes in serum T levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

圖3 三齡偽雄魚與對照組E2周年變化Fig.3 The annual changes in serum E2 levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

圖4 四齡偽雄魚與對照組T周年變化Fig.4 The annual changes in serum T levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

圖5 四齡偽雄魚與對照組E2周年變化Fig.5 The annual changesin serum E2 levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

3 討論

性類固醇激素是一種脂溶性甾體激素，主要功能是調(diào)節(jié)促性腺激素合成與釋放，維持魚類性腺發(fā)育和排卵等生理活動[17]。本研究探討了我國重要經(jīng)濟(jì)冷水性魚類虹鱒偽雄魚及二倍體血清性類固醇激素的表達(dá)變化規(guī)律和性腺特征等，為虹鱒偽雄魚親魚的人工培育和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了重要技術(shù)依據(jù)。

3.1 虹鱒偽雄魚性腺形態(tài)特征

有關(guān)虹鱒性腺發(fā)育模式、組織構(gòu)造等研究已有大量報道[18,19]。本研究比較了偽雄魚和正常二倍體雌、雄魚的性腺組織及形態(tài)，發(fā)現(xiàn)偽雄魚精巢呈鵝卵石形，輸精管卡它性堵塞，要利用偽雄魚需要提取性腺組織，而在組織切片中可以看出偽雄魚精巢保持了雌魚性腺的分化構(gòu)造。偽雄魚培育中，不能保證所有藥餌均被魚攝入，導(dǎo)致后代出現(xiàn)性腺未發(fā)育、性腺發(fā)育成正常雌魚等[20]。所以，正確掌握偽雄魚性腺形態(tài)，在生產(chǎn)中將起決定性作用。

3.2 性激素含量與性別和性腺發(fā)育的關(guān)系

性類固醇激素顯著的影響魚類的生殖過程[21,22],其分泌量可直接反映性腺發(fā)育狀況，還可通過檢測血漿性類固醇激素T的水平較早地鑒別魚的雌雄[23]。本研究通過比較分析3齡和4齡虹鱒偽雄魚、二倍體雄魚及雌魚性類固醇激素T和E2含量,結(jié)果顯示三齡偽雄魚與對照組血清T含量均在12月達(dá)到最高，偽雄魚血清T含量4月份降到最低，隨后逐漸升高，而雄魚和雌魚血清T含量8月降到最低。這也表明偽雄魚和雄魚T的變化同精巢的發(fā)育基本一致，證明了精子成熟須有較高水平的T才能完成[24]。三齡對照組雌魚血清E2含量除12月與偽雄魚無顯著差異外，其余時間都顯著高于雄魚和偽雄魚；對照組雄魚和雌魚血清E2含量10月最高，偽雄魚血清E2含量則在12月最高。三齡偽雄魚E2含量達(dá)峰時間顯著晚于對照組魚，這主要與其發(fā)育遲緩以及生理功能反轉(zhuǎn)密切相關(guān)，偽雄魚的性腺在從雌性向雄性反轉(zhuǎn)的過程中要耗費(fèi)很長時間使機(jī)體適應(yīng)與生理相應(yīng)，因此雌二醇達(dá)峰時間相對順延了。4齡偽雄魚和對照組雌雄魚的E2含量峰值都是在它們的T含量達(dá)峰之前，這個規(guī)律一致，只是偽雄魚E2和T的含量達(dá)峰時間較晚，這主要與其性腺生理結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。周年變化規(guī)律與對照組不一致，可能主要是與偽雄魚的性腺生理機(jī)能退化有關(guān)，驗(yàn)證了E2在促進(jìn)性細(xì)胞成熟中的重要生理功能，與谷偉等[14]對虹鱒選育群體性類固醇激素的研究結(jié)果相一致。據(jù)此，在繁殖季節(jié)12月利用3齡偽雄魚最佳。

以往研究僅分析了初次產(chǎn)卵魚，而未比較分析經(jīng)產(chǎn)魚。本研究顯示，四齡對照組雄魚和雌魚血清T含量均在12月達(dá)到最高，而偽雄魚血清T含量則在翌年2月最高，8月最低，隨后逐漸升高；四齡對照組雌魚血清E2含量除12月和2月外，一年任何時間都顯著高于雄魚和偽雄魚。偽雄魚血清E2含量則在 12月達(dá)最高（326.118±13.620）pg/mL，與雌魚無顯著差異，卻顯著高于雄魚（P＜0.05）。Fostier等[12]認(rèn)為，雌雄親魚血清中T含量，是因?yàn)橛补囚~能合成T，而T可以轉(zhuǎn)變成E2。本研究中雌魚血清中T含量很高，與林浩然等[25]認(rèn)為T是雌激素的前體一致。偽雄魚的E2顯著高于雄魚，認(rèn)為這可能是在偽雄魚培育過程中，未完全抑制雌激素導(dǎo)致。本研究中，偽雄魚血清T含量最高點(diǎn)出現(xiàn)在翌年2月份，與生產(chǎn)中的情況一致，這更加證實(shí)了性類固醇激素分泌量可直接反映性腺發(fā)育狀況。因此，在繁殖季節(jié)4齡偽雄魚的最佳利用時間是在翌年2月份。

本研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒偽雄魚的性類固醇激素周年變化規(guī)律在4齡之前與對照組基本一致，但隨著時間推移，偽雄魚的性腺機(jī)能顯著退化，其性類固醇激素含量波動很大，沒有規(guī)律性，但由于遺傳及環(huán)境的作用，在生殖季節(jié)還是能產(chǎn)生繁殖生理反應(yīng)，這些結(jié)果可作為虹鱒正常二倍體和偽雄魚親魚性腺發(fā)育成熟、有效利用的重要參考。